新型冠狀病毒刺突糖蛋白D614G變異的時間變化和空間分布特征分析

鄧浩輝 李水鳳 樓燕 余衛華 胡肖兵

廣州市第八人民醫院門診部 510060

新型冠狀病毒D614G 變異是刺突糖蛋白（S 蛋白）最常見的變異之一。根據文獻報道，發生該變異的毒株可顯著增強病毒感染能力和傳播能力，并增加患者的致死率。目前包含該變異的新型冠狀病毒毒株時間變化和空間分布特征國內尚未見相關報道，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究納入截止至2020 年7 月21 日在國內外新型冠狀病毒公共數據庫發表的序列，其中包括美國國家生物信息中心（NCBI）GenBank數據庫11 583條，全球共享禽流感數據倡議組織（GISIAD）EpiCoV數據庫69 226條，國家基因庫生命大數據平臺（CNGBdb）75條，國家基因組科學數據中心（Genome Warehouse）37 條，國家微生物科學數據中心（NMDC）數據庫289條。

1.2 去除各數據庫重復的核酸序列 本研究納入5個新型冠狀病毒核酸數據庫的序列數據進行分析，因部分數據庫存在提交序列重復的情況，故根據各序列的信息使用腳本代碼對各序列數據庫進行去重，去重后共納入69 510條新型冠狀病毒核酸序列進行下游分析。

1.3 序列比對與序列數據過濾 對去重后的序列使用Minimap 2 v2.17軟件與新型冠狀病毒參考序列（NC_045512）編碼S蛋白的基因片段進行序列比對，剔除不包含S 基因的序列。比對后的序列進一步過濾，過濾的標準如下：⑴保留從人類身上獲取的病毒序列，剔除宿主為靈長類動物和細胞系等來源的核酸序列；⑵剔除采樣時間信息欠清晰的序列；⑶剔除比對上新型冠狀病毒參考序列S 基因型，但無包含D614G 讀碼框的短序列；⑷剔除包含S 蛋白D614G 讀碼框前后3個堿基測序質量差的序列，如存在N堿基或簡并堿基的序列。

1.4 新型冠狀病毒S 蛋白D614G 變異分析 使用Geneious R11.1.5 軟件對過濾后的新型冠狀病毒進行序列比對，并對S 基因讀碼框進行翻譯，確定所有納入分析序列S蛋白D614G變異情況。

1.5 統計學分析 本研究計數資料采用例數和百分比表示，使用SPSS13.0軟件進行χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義，均取雙側檢驗。

2 結 果

2.1 數據過濾后保留的核酸序列 本研究經數據過濾后最終納入分析的序列56 201 條，其中包括NCBI GenBank 數據庫 8 111 條，GISIAD EpiCoV 數據庫 47 747 條，CNGBdb 數 據 庫 69 條 ，Genome Warehouse 數 據 庫 26 條 ，NMDC 數據庫248 條。其中來自中國的序列1 060 條（1.9%），其他國家來源的序列55 141條（98.1%）。

2.2 D614G變異納入分析核酸序列中存在情況分析 在本研究納入的56 201條新型冠狀病毒核酸序列中，13 570 條（24.1%）序列為野生型，42 631 條（75.9%）序列為D614G 變異型。攜帶D614G 變異的毒株最早在四川（EpiCoV 數據庫 ：EPI_ISL_451345） 和 浙 江 （NMDC 數 據 庫 ：NMDC60013101-01）2020 年 1 月 24 日采集的樣本中被發現，該2株毒株均與來自武漢參考序列的毒株（2019年12月30 日，Genbank 數據庫：NC_045512）序列同源性最高，同源性均為99.9%以上。

2.3 D614G 變異在不同時間分布特征分析 在納入分析不同時間點的核酸序列中，發現攜帶D614G 變異毒株的比例呈明顯上升趨勢。D614 野生型與D614G 變異型的毒株總數和各自構成比如下：2019 年 12 月（21 條，100.0%比 0.0%），2020 年 1 月（452 條，96.9% 比 3.1%），2020 年 2 月（955 條，82.2%比 17.8%），2020 年3 月（24 270 條，34.2%比65.8%），2020 年 4 月（22 085 條，15.3% 比 84.7%），2020 年5 月（6 699 條，8.9% 比 91.1%），2020 年 6 月（1 719 條，3.1%比 96.9%）。自 2020 年 2 月份起至 2020 年 6 月份，D614G 構成比明顯高于2019 年12 月份的數據，均P＜0.05，如圖1所示。

圖1 不同時間點攜帶D614G變異毒株分布情況

2.4 D614G 變異在不同國家分布特征分析 截止至2020 年7 月21 日，在現有新型冠狀病毒公共核酸數據庫納入分析的序列中，公布序列數量前10 的國家和該國公布序列包含D614G 變異毒株數量和構成比如表1 所示。其中D614G 變異構成比最多的國家為比利時（86.7%），其次為英國（79.0%）和美國（76.1%），構成比最少的國家為中國（20.2%）。

2.5 D614G 變異在國內分布特征分析 在本研究納入分析的1 060 條來自中國的序列中，不同時間點D614 野生型（846 條，79.8%）和D614G 變異型（214 條，20.2%）的毒株總數和各自構成比如下：2019 年12 月（21 條，100.0%比0.0%），2020 年 1 月（336 條，98.8% 比 1.2%），2020 年 2 月（313 條，98.4% 比 1.6%），2020 年 3 月（316 條，56.0% 比44.0%），2020 年 4 月（72 條，11.1% 比 88.9%），2020 年 5 月（0 條），2020 年 6 月（2 條，0.0% 比100.0%）。自 2020 年3 月份起至 2020 年 6 月份，D614G 構成比明顯高于 2019 年 12 月份的數據，均P＜0.05。包含D614G的毒株主要分布在廣州（50.9%）、臺灣（27.1%）和北京（10.8%），如圖2A、2B所示。

表1 截止至2020年7月21日納入分析的序列以及主要國家D614G變異毒株的構成比

3 討 論

自2019 年12 月武漢地區發現首例新型冠狀病毒肺炎患者起，截止至2020年7月26日，全球213個國家或地區均有新型冠狀病毒感染的報道；據統計，目前感染新型冠狀病毒的人數為 16 196 503，死亡人數為 648 327［1-2］。根據文獻報道，該病毒的傳染指數（RO）為2～4，提示在人與人之間有高度的傳染性，并可導致較高的病死率［3-4］。因此，新型冠狀病毒感染是目前嚴重的公共衛生問題。

病毒為了適應環境和宿主免疫等因素常導致基因組發生變異，RNA病毒由于復制時保真度較差，更容易在病毒基因組出現變異。病毒大部分變異為無義突變，但小部分變異可致基因組的讀碼框發生改變，從而影響病毒感染能力和致病性等特征［5-6］。新冠病毒S蛋白以三聚體形態存在于病毒衣殼表面，其受體為宿主細胞的血管緊張素轉化酶-2［7-8］。614位點變異是S蛋白主要變異位點之一，D614G變異為野生型的天冬氨酸（D）變異為突變型的甘氨酸（G）［9］。根據文獻報道，D614G 變異后的毒株可增強病毒對宿主的感染能力和增加病毒在人群中的傳播能力［10-12］，并可增加新型冠狀病毒感染者的病死率［13-14］。因此，了解包含新型冠狀病毒S 蛋白D614G 變異毒株的時空分布和流行病毒學特征有重要的意義。

圖2 D614G變異在國內分布特征；A：國內不同時間點D614G變異毒株分布特點；B：D614G變異毒株在國內分布情況

本研究中，筆者納入了國內外新型冠狀病毒序列數據庫的56 201 條核酸序列進行分析，結果提示目前數據庫包含D614G 變異的毒株為75.9%，最早出現在中國四川和杭州等地，其與武漢最早發布的序列同源性最高，提示包含該變異的毒株可能直接起源于武漢。進一步對該變異毒株進行分析，提示目前攜帶D618G變異毒株主要分布在國外，構成比最高的國家為比利時，其次為英國和美國。筆者對不同時間的新型冠狀病毒序列進行分析，結果提示攜帶D614G 變異毒株的構成比呈明顯上升趨勢；對國內不同時間點的序列分析的結果也提示，攜帶D614G 毒株在2020 年3月份后呈明顯上升趨勢，且國內主要分布在廣州和北京等地區，結合本院和廣州地區的實際情況，在公共數據庫中攜帶該變異的毒株構成比上升可能與本地區輸入性病例增加有密切關系。

綜上所述，筆者對國內外公共數據庫新型冠狀病毒序列進行分析，闡述了攜帶S 蛋白D614G 變異的新型冠狀病毒毒株時間和空間分布特征。因病毒變異可能隨時間和空間而變化，應繼續對該毒株進行研究，進一步了解其流行病學特征和變化規律。本研究僅對公共數據庫核酸序列進行數據分析，其結果可能不一定完全代表真實情況，下一步應采集臨床樣本進行病毒變異檢測，進一步對其變異株進行驗證。根據本研究的結果，攜帶D614G 變異的毒株目前呈上升趨勢，在新型冠狀病毒疫情常態化管理階段，應繼續按疫情防控的要求對輸入性病例進行嚴格管理［15-16］，警惕和嚴防輸入性病例在國內傳播的風險。