規模化奶牛場臨床型乳房炎病原菌的分離鑒定

劉 歡，郭 伶

（錦州醫科大學畜牧獸醫學院，遼寧錦州 121001）

奶牛乳房炎是一種嚴重危害乳品行業并普遍發生的疾病，在美國的發病率為40%，在中國的發病率高達60%～70%，造成巨大的經濟損失[1-2]。在中國，每年因乳房炎造成的經濟損失達30 億元[3]，乳房炎的發病情況更嚴重[4-5]。奶牛乳房炎是由于乳腺發生外傷、感染等因素而導致的炎性反應，在飼養奶牛的過程中非常容易發病，并且藥物治療成本較高，屬于較難進行防治和診斷的疾病之一，嚴重威脅著我國的動物性食品安全[6]。臨床上造成奶牛乳房炎的因素復雜多樣。乳房炎引起牛奶品質下降，降低奶牛產奶的性能，進而導致出現棄奶、藥物治療的費用也會隨之增加，影響養殖效益。因此，必須對奶牛乳房炎的病原菌的分離鑒定采取措施，盡可能減少經濟損失[7-8]。文章對奶牛乳房炎的病原菌的分離鑒定進行研究，為乳房炎中病原菌的分離鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及儀器

吊菌環、顯微鏡、培養箱、培養基、高壓蒸汽滅菌鍋、載玻片、培養皿、滅菌試管等。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集

乳房炎奶樣采自遼寧某奶牛場。首先用溫水清洗患區，用酒精棉球對乳頭進行消毒，棄去頭2把乳。以無菌操作的方法將適量乳汁擠入滅菌試管中,并將乳樣擠在瓊脂斜面上，并做好標記。采集的樣品冷藏保存，并盡快分離細菌。臨床型乳房炎判定標準：乳房有明顯的炎癥癥狀、乳區出現紅腫熱痛、擠奶時奶牛抗拒、擠出的奶樣中有絮狀沉淀或顏色變化[9]。

1.2.2 細菌分離

充分搖勻采集的無菌奶樣，分別劃線接種于普通瓊脂平板、胰蛋白胨大豆肉湯瓊脂平板、腦心浸液瓊脂平板和麥康凱瓊脂培養基接種劃線，做好標記，置于37 ℃培養箱中24 h然后進行觀察。

1.2.3 細菌涂片、染色、鏡檢

使用接種環取少量蒸餾水，放在載玻片的中央，選擇少量可疑菌落與蒸餾水中混合均勻，干燥后進行火焰固定。進行革蘭氏染色，顯微鏡觀察。根據菌體形態、溶血情況及染色特性初步判斷細菌類別，并進一步純化和培養。

1.2.4 細菌的分離培養及形態學鑒定

選擇疑似大腸桿菌，鏈球菌和金黃色葡萄球菌的菌落涂片，革蘭染色，鏡檢觀察染色特性、形態和菌體排列。革蘭染色鏡檢可見到在顯微鏡下呈兩端鈍圓的淡紅色短桿菌[10]，初步判斷為大腸桿菌；可見單一、成對或成鏈的革蘭氏陽性細菌，初步判斷為鏈球菌；還可見呈革蘭氏陽性葡萄串狀球菌存在，初步判斷為金黃色葡萄球菌。

2 結果與分析

2.1 細菌在各種培養基中的生長結果（見表1）

表1 細菌在各種培養基中的生長結果Tab.1 Bacteria growth results in various media

由表1 可知，金黃色葡萄球菌在營養瓊脂上生長為圓形、光滑、略微凸起的中等大小菌落；在腦心浸液培養基上生長為圓形、中等大小菌落；而在麥康凱瓊脂和胰蛋白胨大豆肉湯上則不生長。鏈球菌在營養瓊脂上生長不良；在胰蛋白胨大豆肉湯培養基中生長良好；而在麥康凱瓊脂和腦心浸液培養基中不生長。大腸桿菌在營養瓊脂上生長為灰白色露珠樣、凸起、邊緣光滑整齊的菌落；在麥康凱瓊脂上生長為中等大小的紅色菌落；而在胰蛋白胨大豆肉湯和腦心浸液培養基上不生長。

2.2 細菌在培養基中的形態觀察（見圖1～圖3）

圖1 金黃色葡萄球菌生長狀態和形態結構Fig.1 Growth status and morphological structure of Staphylococcus aureus

圖2 鏈球菌生長狀態和形態結構Fig.2 Growth status and morphological structure of Streptococcus

由圖1～圖3 可知，金黃色葡萄球菌革蘭染色陽性球菌，呈葡萄狀排列；鏈球菌為革蘭氏陽性球菌、無芽孢、無莢膜、菌體呈鏈狀排列；大腸桿菌為革蘭染色陰性桿菌、兩端鈍圓，呈紅色或粉紅色、無芽孢、無莢膜。

圖3 大腸桿菌生長狀態和形態結構Fig.3 Growth status and morphological structure of E.coli

2.3 細菌的分子生物學鑒定（見圖4）

圖4 分離菌株PCR擴增結果Fig.4 PCR amplification results of isolated strains

由圖4可知，分別用大腸桿菌、鏈球菌和金黃色葡萄球菌的引物擴增該分離菌DNA 后獲得大小約為1 262、689和420 bp 左右的目的片段，與大腸桿菌引物、鏈球菌引物和金黃色葡萄球菌特異性引物預期片段大小一致，并且空白對照組無目的片段出現。

3 討論

此次共采集乳樣26份，24份分離出病原菌，分離率達到92.3%，單一菌感染占76.5%，混合感染占15.8%。對病原菌的分離鑒定可知，引起奶牛乳房炎的病原菌種類繁多并且還與地域、環境等因素密切相關。其主要致病菌是大腸桿菌、鏈球菌以及金黃色葡萄球菌。

本次分離結果以大腸桿菌為主，其次是葡萄球菌和鏈球菌。細菌的分離和鑒定是乳房炎防治技術研究的基礎。乳房炎仍然是乳制品生產中最常見和最嚴重的疾病之一，對乳制品生產的經濟效益，甚至對改善牛奶質量具有重大意義。消費者對于牛奶的質量要求越來越高，改善牛奶質量防治乳房炎已經成為研究人員普遍關注的問題。奶牛乳房炎是一種感染性疾病[11]。引起乳房炎的因素有很多，主要原因是病原微生物[12]。由于地理環境、飼養管理水平、常用抗菌藥物等方面的影響，不同地理區域甚至同一地區不同牛場奶牛乳房炎病原菌的流行情況差異也很大[13]。隨著人民對物質生活水平要求的提高，對乳品的需求大大增加，奶牛養殖量也逐年提升，為促進奶牛產業的穩定發展，有必要進一步加強對乳房炎的綜合防治和研究。

4 結論

共采集26 份樣品分離出17 個菌株，其中大腸桿菌10 株，葡萄球菌5 株，鏈球菌2 株，可知養殖場奶牛乳房炎是由多種病原菌引起的。