黃芪益丹合劑檢測方法研究

車曉菲，張肖建,2，王紅志,2，郭永紅,2，郗艷菊,3★

（1.河北維爾利動物藥業(yè)集團有限公司 050200；2.河北省中獸藥產(chǎn)業(yè)技術研究院 050200；3.河北省功能性添加劑技術創(chuàng)新中心 050200）

黃芪益丹合劑是在《中華人民共和國藥典》“當歸補血口服液”[1]基礎上進行組方加減，由黃芪、當歸、黃柏、肉蓯蓉、益母草、丹參等中藥配方組成，按規(guī)定工藝制備而成的口服液，用于預防和治療蛋雞輸卵管炎。 處方中黃芪、當歸、黃柏是三大主要組分，而肉蓯蓉價格高可算“貴重藥材”，為有效地控制產(chǎn)品質(zhì)量，本試驗參考2015 年版《中華人民共和國獸藥典》[2]中相關質(zhì)量標準，制定了如下研究方案： ①通過TLC 法定性鑒別肉蓯蓉； ②通過HPLC 法測定毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、鹽酸小檗堿的含量。本試驗以黃芪益丹合劑檢測方法為研究對象， 研究復方中藥制劑定性檢測的專屬性以及定量檢測的可靠性， 為黃芪益丹合劑的檢驗分析提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

UltiMate 3000 高效液相色譜儀 （德國Thermo 公司），DAD檢測器，變色龍工作站；AUW120D 型電子天平（日本SHIMADZU公司）；DZKW-4 電子恒溫水浴鍋 （北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；ZF-20D 臺式紫外分析儀（上海貝侖儀器設備有限公司）

1.2 主要試劑與對照品

松果菊苷對照品（批號19092501，含量87.15%），毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（批號19031302，含量93.12%），鹽酸小檗堿對照品 （批號19050604， 含量94.08%）， 阿魏酸對照品 （批號110773-201604，含量99.0%），阿魏酸對照品購于中國食品藥品檢定研究院，其他對照品購于成都格利普生物科技有限公司；甲醇、乙腈、磷酸為色譜純。

1.3 藥材

黃芪、當歸、益母草、丹參、黃柏、茵陳、茯苓、巴戟天、肉蓯蓉、青皮、川楝子等11 味藥材均購于安國藥材市場，經(jīng)本公司質(zhì)控部鑒別均符合《中華人民共和國獸藥典》2015 版（二部）有關項下規(guī)定。

1.4 樣品制備方法

黃芪益丹合劑樣品的制備：處方中黃芪200g、當歸150g、益母草100g、丹參100g、黃柏150g、茵陳100g、茯苓50g、巴戟天50g、肉蓯蓉50g、青皮25g、川楝子25g，共計11 味，總重1kg。 將配好的藥材加水煎煮2 次，每次煎煮時間2h，加水量分別為10倍和8 倍，合并煎液，濾過，濾液濃縮至1000mL 左右，加入0.6%苯甲酸鈉，放冷，靜置24h，濾過，濾液加水制成1000mL，即得。

2 結果與分析

2.1 定性鑒別

2.1.1 肉蓯蓉的薄層鑒別

取黃芪益丹合劑供試品5mL，水浴蒸干，加甲醇20mL，超聲處理20min，過濾，蒸干，殘渣加甲醇5mL 使溶解，作為供試品溶液；取松果菊苷對照品適量，加甲醇制成每1mL 含1mg 的溶液，作為對照品溶液；另按供試品工藝制備不含肉蓯蓉的陰性樣品，同法制成陰性對照溶液；照2015 版《中華人民共和國獸藥典》[2]“附錄0502”薄層色譜法試驗，吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各2μL，分別點于同一聚酰胺薄層板上，以甲醇-醋酸-水（2∶1∶7）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視。 結果見圖1。 由圖1 可知，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾。

圖1 肉蓯蓉TLC 圖

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相：以乙腈為流動相A，以0.1%磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫程序見表1；流速：1.0mL/min；檢測波長：全波長掃描（0～9min 毛蕊異黃酮葡萄糖苷檢測波長為260nm，9 ～13min 阿魏酸檢測波長為314nm，13～35min 鹽酸小檗堿檢測波長為345nm）； 柱溫：30℃；進樣量：10μL。

表1 梯度洗脫程序

2.2.2 制樣方式考察

精密量取供試品5mL， 置25mL 棕色量瓶中， 平行取樣3份， 編號1、2、3， 分別加入100%甲醇、70%甲醇和60%甲醇約20mL，超聲處理（功率200W,頻率50kHz）10min，取出，放冷，定容至刻度，離心，取上清液，濾過，即得供試品溶液。

按“2.2.1”項下規(guī)定的色譜條件行分析，結果見表2、圖2。由表2、圖2 可知：用70%甲醇制備供試品溶液，目標成分的回收率較高，故選用70%甲醇超聲處理作為供試品溶液制備方式。

表2 不同提取溶劑對含量測定的影響

圖2 不同提取溶劑對含量測定的影響

2.2.3 供試品溶液及陰性樣品溶液的制備

精密量取本品5mL，置于25mL 棕色容量瓶中，加70%甲醇約20mL，超聲處理（功率200W,頻率50kHz）10min，取出，放冷，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，離心取上清液，0.45μm 微孔濾膜濾過，即得。 按“1.4 樣品制備方法”項下的工藝制備不含黃芪、當歸、黃柏的陰性樣品，并按上述供試品溶液的制備方法制備陰性樣品對照溶液。

2.2.4 對照品溶液的制備

圖3 不同波長下各成分HPLC 色譜圖

取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品、 阿魏酸對照品和鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL 含毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品50μg、 阿魏酸對照品50μg 和鹽酸小檗堿對照品15μg 的混合對照品溶液，即得。

2.2.5 專屬性考察

分別精密吸取對照品溶液、 陰性對照品與供試品溶液各10μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。 對專屬性進行考察。 結果表明，陰性樣品對測定無干擾，結果見圖3。

2.2.6 線性關系考察

精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品50mg、阿魏酸對照品50mg 和鹽酸小檗堿對照品15mg，置100mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品儲備液。 精密量取混合對照品儲備液1mL，依次用甲醇稀釋至50mL、25mL、12.5mL、5mL、2.5mL、2mL，作為混合對照溶液，分別精密量取10μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以濃度作為橫坐標（X，μg/mL）,色譜峰峰面積作為縱坐標（Y，mAU★min），進行線性回歸計算。

結果： 毛蕊異黃酮葡萄糖苷 （260nm） 回歸方程為Y=0.5492X-0.1132，R2=0.9999， 在9.3604～234.01μg/mL 范圍內(nèi)線性關系良好； 阿魏酸 （314nm） 回歸方程為Y=0.2425X-0.155，R2=0.9997，在9.7496～243.74μg/mL 范圍內(nèi)線性關系良好；鹽酸小檗堿 （345nm） 回歸方程為Y=1.9199X+0.1333，R2=1，在3.9514～98.785μg/mL 范圍內(nèi)線性關系良好。

2.2.7 重復性考察

取同一批樣品（批次：20200701），按取樣量0.5：1.0：1.5 的比例分別取樣，各平行3 份，按供試品溶液制備的方法制備，照上述色譜條件測定，分別計算毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸和鹽酸小檗堿的平均含量及平均含量的RSD 值， 考察方法的重復性。測得平均含量分別為：毛蕊異黃酮葡萄糖苷=0.113mg/mL,RSD=0.90%；阿魏酸=0.130mg/mL,RSD=0.93%；鹽酸小檗堿=0.202mg/mL,RSD=0.75%，結果表明該方法重復性良好。

2.2.8 精密度考察

取同一供試品溶液，按確定的色譜條件連續(xù)進樣6 次，分別記錄毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸和鹽酸小檗堿色譜峰峰面積，并分別計算峰面積的RSD 值，考察方法的精密度。 測得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸和鹽酸小檗堿色譜峰峰面積RSD 值分別為：0.22%、0.26%和0.16%，表明該方法精密度良好。

2.2.9 穩(wěn)定性考察

取同一供試品溶液，分別于0,4,8,12,18,24h 進樣1 次，分別記錄毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸和鹽酸小檗堿色譜峰峰面積，并分別計算峰面積的RSD 值，考察方法的穩(wěn)定性。 測得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸和鹽酸小檗堿色譜峰峰面積RSD 值分別為：0.52%、0.56%和0.47%， 表明供試品溶液在24h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.10 準確度考察

精密量取“2.2.5”項下混合對照儲備液1.0mL 加甲醇稀釋并定容至10mL， 作為混合對照溶液。 取同一批樣品 （批次：20200701）作為供試品，平行9 份，每份2.0mL，平均分成3 組。第一組加混合對照溶液1.0mL， 第二組加混合對照溶液3.0mL，第三組加混合對照溶液5.0mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項下色譜條件下測定。 記錄峰面積并計算回收率，考察方法的準確度。 測得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸和鹽酸小檗堿的回收率均在98%～102%之間。 結果：

毛蕊異黃酮葡萄糖苷平均回收率=99.56%，RSD=0.98%（n=9）；阿魏酸平均回收率=100.21%， RSD=1.22%（n=9）；鹽酸小檗堿平均回收率=100.06%，RSD=0.77%（n=9）， 結果表明該方法準確度符合要求。

2.3 樣品測定

取9 批樣品，每批平行樣個數(shù)n=3，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項下色譜條件下測定，計算含量。 結果見表3：

表3 各成分含量測定結果

3 討論

本試驗參考肉蓯蓉在《中華人民共和國獸藥典》[2]中標準規(guī)定以及研究文獻[3-4]，通過TLC 薄層色譜條件的摸索，篩選出最佳展開條件，完成肉蓯蓉TLC 鑒別檢驗方法的制定。 在探索過程中發(fā)現(xiàn)：供試品色譜中，在與松果菊苷對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點。 而陰性對照液色譜中，在與松果菊苷對照品色譜相應的位置上，未顯示熒光斑點。 由此可見，松果菊苷可作為鑒別肉蓯蓉的專屬指標。

中醫(yī)藥理論強調(diào)的是整體觀念的原則。 中藥復方制劑中化學成分復雜，有效成分往往難以確認，只對單一成分進行檢測，無法體現(xiàn)制劑整體質(zhì)量情況以及中醫(yī)藥的整體性特點， 所以中藥復方制劑質(zhì)量評價應進行多組分檢測。 在黃芪益丹合劑處方中黃芪、當歸、黃柏是三大主要組分，而毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸和鹽酸小檗堿分別為黃芪、當歸、黃柏的主要活性成分。 經(jīng)查閱文獻[5-12]，建立了同時測定此3 種成分含量的高效液相色譜法。 對毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品、阿魏酸對照品和鹽酸小檗堿對照品進行全波長掃描，譜圖同文獻[13-16]結果一致，故確定檢測波長分別為260nm、314nm、345nm，通過HPLC 全波長掃描同時測定毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸和鹽酸小檗堿的含量。 建立中藥制劑質(zhì)量標準和分析手段時，應采取準確、靈敏、可行的分析方法，測定多種有效成分，才能更加科學客觀的評價中藥制劑質(zhì)量。 隨著中藥化學成分研究分析方法學與制劑工藝學研究的不斷深入和發(fā)展，中藥制劑分析的靈敏度、準確度和穩(wěn)定性，將會逐步提高，以滿足中藥制劑質(zhì)量控制的實際需求。

4 結論

中藥制劑分析以中藥理論為指導， 應用現(xiàn)代分析理論和方法， 研究中藥制劑質(zhì)量， 如何確定質(zhì)量評價的指標是其關鍵問題。 本試驗通過TLC 定性鑒別和HPLC 定量測定來進行組分檢測方法的研究， 樣品前處理條件以及系統(tǒng)適用性均經(jīng)過對比驗證，最終選擇以70%甲醇作為制樣溶劑，影響因素及中間精密度考察RSD 值均小于2%，結果表明此檢測方法專屬性高、準確可靠，可為黃芪益丹合劑提供有效的質(zhì)量控制方法。 中藥制劑有已知成分又有未知成分，不確定因素諸多，分析難度大，存在問題多，極具挑戰(zhàn)性，對藥物分析工作者而言任重而道遠。