上調A20表達對阿爾茨海默病小鼠海馬組織神經元的保護作用*

孫麗慧 張萌 郎尉雅 王月靜 張海燕 馮化杰

齊齊哈爾醫學院,黑龍江 齊齊哈爾 161001

阿爾茨海默病是一種神經退行性疾病，它可引起中樞神經系統損傷和變性，隨著年齡的增長該病呈持續性的發展，目前全世界患病人數已達3000萬人以上，阿爾茨海默病患者臨床表現為學習記憶力顯著下降，嚴重的患者不認識自己的家人、朋友，導致其不能與人正常交流，很難照顧自己的生活起居，給患者的家屬增添了經濟負擔和精神負擔。這使患者家屬的心理壓力不斷增加，給患者和家屬帶來痛苦，因此尋求有效的治療方法迫在眉睫，有研究發現ZBTB20缺陷導致了海馬發育的嚴重障礙，推測ZBTB20是調控海馬CA1神經元的細胞命運和海馬發育的關鍵分子。近年學者發現，鋅指蛋白在老年癡呆小鼠模型中有一定影響，但可能機制尚不清楚。鋅指蛋白是一類具有手指狀結構域的轉錄因子，在基因表達調控、細胞分化、胚胎發育方面具有重要的作用。近年來已成功設計了特異性鋅指蛋白元件用于調節與疾病相關基因的表達，為臨床基因治療疾病提供了廣闊的前景。本研究構建了鋅指蛋白A20基因重組腺病毒，進一步研究上調鋅指蛋白A20表達是否修復阿爾茨海默病模型小鼠神經細胞的損傷，為改善和修復受損的海馬神經元提供依據。

1 材料和方法

1.1主要試劑及實驗動物 腺病毒載體A20 購自上海吉凱公司，健康12w齡雄性 AD 小鼠，體質量25-30 g，購自南京大學實驗動物中心[可證號 IACUC-DB-16-0602]。動物在適應環境 1周后開始實驗。實驗均在標準清潔級動物實驗室內完成。實驗前禁食 12 h，自由飲水。

1.2實驗方法 將 30只小鼠隨機分3組：對照組，AD組，A20-AD組(海馬內注射高表達A20慢病毒)，麻醉后用腦立體定位儀定位在海馬位置并固定，A20注入海馬內，將攜帶高表達A20慢病毒注射海馬內1min內推完。

1.3甲苯胺藍染色法檢測海馬組織神經元變化 取材后取海馬組織，將組織制成蠟塊，用石蠟切片機切片、脫蠟、水化，染色后脫水，封片: 中性樹膠; 觀察海馬神經元變化。

2 結 果

甲苯胺藍染色法檢測海馬組織神經元變化，結果發現，與AD組比較，A20-AD組海馬神經元形態發生改變，損傷的神經元被修復，神經元形態變得規則飽滿，損傷神經元數量減少，提示上調A20表達可修復阿爾茨海默病損傷的海馬神經元。

3 討 論

阿爾茨海默病患者主要臨床表現為認知障礙及精神行為異常，患者的生活質量顯著下降,由于患者學習記憶力能力減退[1-2]，導致患者可能走失的概率增加，患者判斷力、語言能力減退及視空間障礙，這些癥狀可導致患者跌倒及發生意外，隨著病情逐漸加重，患者會出現精神障礙，如：焦慮、抑郁、睡眠障礙等[5-9]，阿爾茨海默病的主要病理特征為β-淀粉樣蛋白(amyloid-beta，Aβ)沉積于腦內形成老年斑(senile plaques，SP)，以及大量神經纖維纏結并伴隨著神經元減少以及軸索和突觸異常、顆粒空泡變性等。現代醫學對AD的研究雖然已進入到基因、分子水平，但其病因迄今不明[10-11]。一般認為AD是復雜的異質性疾病，多種因素(遺傳因素、神經遞質、免疫因素、環境因素等)可能參與致病。現普遍認同的發病機制一般有: Aβ學說，Tau 蛋白學說，載脂蛋白E基因，中樞膽堿能損傷，興奮性氨基酸毒性學說，胰島素信號傳導途徑，膽固醇代謝異常等。患者嚴重時需要照顧全部的日常生活，這給家屬帶來沉重的精神及經濟負擔，這種疾病無特效藥物，因此，尋求有效的治療藥物至關重要，本研究構建了鋅指蛋白A20基因慢病毒，進一步研究上調鋅指蛋白A20表達是否修復阿爾茨海默病模型小鼠神經細胞的損傷，鋅指蛋白A20的特點是什么呢？

A20最初作為人臍靜脈內皮細胞中的TNF。誘導基因被發現，因此也被稱為TNFa誘導蛋白3( TNFAIP3)，A20蛋白的結構域中包含N末端(1-385)和C末端(386-775)，其中N末端區具有一定的特征性，稱為特征性結構區，該區域與已知的蛋白質結構都無同源性;另一端又稱C末端的結構域為鋅指區，因此，A20又稱鋅指蛋白，A20是抑制多種細胞內信號通路的重要的抗炎分子，在脂多糖(LPS)誘導的巨噬細胞中，發現A20上調，而A20與白介素受體1相關激酶(IRAK 1)的相互作用是內毒素耐受的決定因素，在腸上皮細胞中，A20也具有誘導LPS耐受的功能。A20不僅具有重要的免疫調節作用，也是有效的腫瘤抑制因子，A20通過調節NF-KB信號通路的轉導來發揮作用，鋅指蛋白A20可以連接到多種功能蛋白(如ABINs、LMP1、14-3-3等)，A20的鋅指區連接到這些功能蛋白后可發揮對機體的保護作用[4]，有研究發現鋅指蛋白在神經細胞中能抑制細胞凋亡、壞死及炎性反應等過程，前輩研究發現鋅指蛋白A20在正常毛細胞中沉默表達，受到損傷后毛細胞會出現鋅指蛋白A20的短暫表達，由于低量和短時間表達A20很難對毛細胞起到保護作用，上調A20的表達可對損傷細胞起到保護作用，這與我們的研究結果相似的，我們的研究結果發現，上調A20的表達可修復損傷的海馬神經元細胞，因此，我們初步探究作用，然而，它的具體作用機制還需要我們繼續研究。