速度向量成像技術定量評價健心顆粒對心力衰竭大鼠左房功能的影響

歐陽秋芳 郭進建 游 濤 姚涵文 劉磊磊 連艷平 林濟欽 曹 斌 蘇林丘

(福建中醫藥大學附屬第二人民醫院 福建福州 350003）

左房功能是左心室舒張期灌注的決定因素，它間接反映左室的充盈壓力，當心力衰竭時，左室舒張末期充盈壓增加，左房后負荷升高，導致左房結構發生形變、功能受損。另外，左房功能下降，導致房內壓力升高，不利于靜脈血液回流，間接影響心室射血[1]。因此，左房功能與左心室舒張收縮功能密切相關而且相互影響，評價左房功能對疾病的病情評估、療效觀察和預后判斷具有重要意義[2]。

速度向量成像（velocity vector imaging， VVI），采用實時心肌運動跟蹤運算法，計算并以矢量方式顯像二維超聲心動圖上組織結構的活動方向、速度、距離時相等，對心肌組織在多個平面運動的結構力學進行量化分析，能定量測量心肌組織運動的速度、位移、應變率等參數，為評價左房功能提供了更準確、簡便的方法[3][4]。但目前尚無用VVI技術定量評價大鼠左房功能的文獻報道。

本研究團隊研究表明：根據溫陽益氣、活血利水法配制的院內制劑——健心顆粒，能顯著改善心功能[5]，通過腎素-血管緊張素-醛固酮系統（RAAS）調節神經內分泌細胞因子，抑制左室肌纖維化[6][7]。但是健心顆粒是否改善心衰大鼠左房結構與功能，尚無文獻報導。因此，本文擬用VVI技術定量評價健心顆粒對心衰大鼠左房功能的影響，旨在證實VVI技術定量評價大鼠左房功能的可行性；并以此為技術手段，闡明健心顆粒是否通過改善左房功能治療心力衰竭的新機制。

一、材料與方法

（一）藥物的來源、組方及制備

健心顆粒原藥材購于福建省藥材公司，經鑒定后按照相關的制劑和質量標準由本院制劑室制成顆粒劑。

（二）動物模型及分組

將體重200g左右的SD大鼠50只，隨機分成假手術組、模型組、健心顆粒小劑量組（劑量1.8g/kg/d）、健心顆粒大劑量組（劑量3.6g/kg/d）、苯那普利組（給予劑量10mg/kg/d），每組10只。按孫慶怡等報道的方法[8]，采用縮窄腹主動脈法制備慢性心衰大鼠模型。假手術組大鼠在游離腹主動脈后不結扎。于造模后第7天用多普勒超聲測腹主動脈的狹窄程度，判斷模型是否成功。對造模成功大鼠于第8天開始按上述方案灌胃給藥，假手術組和模型組給予相同劑量的生理鹽水。干預12周后進行相關實驗研究。

（三）超聲心動圖分析左室功能及速度向量成像技術分析左房應變率

采用10%水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射麻醉下采用西門子（Acuson S 2000型）超聲儀進行超聲心動圖檢查，剃掉大鼠胸前的毛，鋪超及導聲墊，M型和二維超聲心動圖測量左房左右徑（left atrial diameter， LA）、左室舒張末期內徑（left ventricular end diastolic diameter， LVEDD）、室間隔舒張末期厚度（interventricular septal end diastolic thickness， IVST）、左室射血分數（left ventricular ejection fraction， LVEF）與縮短分數（left ventricular shortening fraction， LVFS）。

超聲儀自帶分析軟件為syngo US Workplace VVI自動分析軟件。采集心尖四腔心連續3個心動周期動態超聲圖，啟動VVI模式，在標準心尖四腔心切面顯示清晰的房間隔和側壁，連續采集3個心動周期的動態圖像，存儲后脫機分析。分析時，將圖像幀頻回放到左室收縮末期，逐點勾畫心內膜邊界，VVI軟件將自動生成速度應變向量圖（圖1）。在四腔心切面自動獲取收縮期峰值應變率（left ventricular peak systolic strain rate，SR-s）、舒張早期峰值應變率（left ventricular peak early diastolic strain rate，SR-e）及舒張晚期峰值應變率（left ventricular peak latediastolic strain rate，SR-a）的測量并記錄，其中SR-s對應心電圖的QRS波群起始點至T波終末期，SR-e、SR-a分別對應T波終末開始至QRS波群起始點之間。測得計算平均值，并記錄。

圖1

（四）ELISA法測血漿AngII、BNP水平

因血管緊張素II（Ang II）可致心房肌纖維化，而N末端腦鈉肽（NT-proBNP）反映心功能，故血漿檢測上述指標。斷頭取血，2ml血注入含10%二乙胺四乙酸二鈉30μl和抑肽酶40試管中，混勻，4℃，3000r/min離心10min，分離血漿，-20℃存放。測定前冷水中復融，再次4℃，3000r/min離心5min后，取上清液，采用非平衡法測定。將聚苯乙烯試管編號，經過加液程序后混勻，4℃，3500r/min離心20min，吸取上清液，采用免疫放射法測定。在半對數坐標紙上繪制標準曲線，查出樣品值。

（五）原位缺口末端標記法評估左房肌細胞凋亡

因細胞凋亡與左房功能密切相關，故檢測凋亡程度。采用原位缺口末端標記（TdT-mediated dUTP nickend labeling， TUNEL）法對各組所取組織用10%中性緩沖福爾馬林固定，常規石蠟切片。按“原位細胞凋亡檢測試劑盒”說明進行檢測。

（六）MASSON染色分析左房間質纖維化

打開已測定好血壓大鼠的胸腔，分離心臟，切取左心耳并用10%中性甲醛固定。石蠟包埋，取左心耳冠狀面最大橫徑處切片，行MASSON染色。膠原纖維染成藍色，胞漿、肌纖維呈紅色，而胞核為黑藍色。膠原容積分數（collagen volume fraction， CVF）是指視野中膠原染色的區域面積占總面積的百分比。每張切片上隨機選取8個視野，通過使用Image Pro Plus軟件（version 6.0， USA）計算CVF來反映左心房纖維化程度，計算CVF時視野中血管周圍區域不記入內。

（七）左房組織Western blot方法檢測Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原表達

采用Western blot方法檢測左房肌組織膠原蛋白的表達。提取左房總蛋白，進行蛋白質濃度定量后，對蛋白樣品進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，封閉。采用Abcam公司抗體，以1：2000稀釋I型和III型膠原一抗，二抗孵育，免疫印跡顯色。以GAPDH作為內參，進行半定量分析，用圖像分析系統對圖片進行灰度掃描，比值表示其相對含量。

（八）統計學處理

使用SPSS 19.0軟件，符合正態分布的計量資料用均數±標準差表示，均數比較采用成組設計單因素方差分析，組間均數比較采用LSD法。非正態分布資料采用Mann-Whitney U檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

二、結果

（一）AngII、NT-pro BNP水平、左室功能與左房峰值應變率

如表1，模型組和各治療組的Ang II、NT-pro BNP水平均明顯高于假手術組（P＜0.05）。與模型組比較，各治療組上述指標均顯著降低（p＜0.05）。超聲心動圖結果顯示：與假手術組比較，模型組左室射血分數（EF）、縮短分數（FS）減低，而室間隔厚度（IVST）、左室舒張末徑（LVEDD）、左房徑增加，說明腹主動脈縮窄所致心力衰竭建模成功。低、高劑量健心顆粒或苯那普利治療后，EF、FS增高，IVST、LVEDD減低，說明治療后左心功能改善。

與假手術組比較，模型組左房SR-s（儲庫功能，0.96±0.07 vs 1.95±0.14，p＜0.01）與SR-a（輔泵功能，-0.57±0.05 vs -1.32±0.19，p＜0.01）顯著增強，而SR-e（管道功能，-0.75±0.04 vs-0.36±0.05，p＜0.01）減弱。健心顆粒或苯那普利治療后，SR-s、SR-a降低，而SR-e增加。

表1 各組血漿Angll、血漿NT-pro BNP、左室超聲分析及左房應變率比較

（二）左房肌細胞凋亡

與假手術組相比，模型組左房凋亡細胞數明顯增加（23.16%±3.19% vs 2.41%±0.47%，p＜0.01）。盡管健心顆粒治療后的左房凋亡細胞數仍較假手術組嚴重（各治療組均p＜0.01），但與模型組比較，高劑量健心顆粒治療后，細胞凋亡明顯減少（12.45%±2.16% vs 23.16%±3.19%，p＜0.01），與苯那普利組（10.60%±1.57%）比較，差異無統計學意義。低劑量健心顆粒治療，細胞凋亡數稍減低（18.93±2.08），但與模型組比較（23.16%±3.19%），差異無統計學意義。

圖2 左房肌組織的TUNEL染色結果（細胞核呈藍綠色，凋亡細胞呈棕褐色，模型組大鼠心房肌凋亡細胞高于假手術組，健心顆粒、苯那普利治療后，凋亡程度減輕。統計數據表示為x±s，n=10。與假手術組比較，*p＜0.05；與模型組比較，#p＜0.05。（×400）

（三）左房間質纖維化

膠原容積分數（CVF）代表左房纖維化的嚴重程度，Masson染色時膠原纖維呈藍色，肌纖維和纖維素呈紅色，藍色染色面積的百分比為膠原容積分數。與假手術組相比，模型組左房CVF顯著增加（24.52%±2.41% vs 3.65%±0.44%，p＜0.01）。盡管健心顆粒治療后的左房肌纖維化仍較假手術組嚴重（各治療組均p＜0.05），與模型組相比，健心顆粒低劑量和高劑量治療組CVF顯著降低（JXKL-和JXKL-H與模型組：15.53%±2.12%和8.94%±1.07% vs 24.52%±2.41%；p＜0.001），兩組治療均達到顯著性差異。健心顆粒高劑量治療組與苯那普利組間差異無統計學意義（8.94%±1.07% vs 6.68±0.73，p＞0.05）。

圖3 左房肌組織Masson染色，膠原纖維呈藍色，肌纖維和纖維素呈紅色，模型組大鼠心房肌纖維化程度高于假手術組，健心顆粒、苯那普利治療后，纖維化程度減輕。統計數據表示為±s，n=10。與假手術組比較，*p＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。（×400）

（四）左房肌Ⅰ、Ⅲ型膠原表達

與假手術組比較，模型組I、III型膠原表達及I/III型膠原比值均增加（I型：1.35±0.20 vs 0.43±0.05；III型：0.97±0.12 vs 0.41±0.06；I/III膠原比值：1.39±0.13vs1.05±0.03，），提示腹主動脈所致心衰大鼠左房出現膠原沉積，并以I型膠原增加為主。與模型組比較，低劑量及高劑量健心顆粒均抑制Ⅰ型（0.95±0.08和0.72±0.12 vs 1.35±0.20）和Ⅲ型膠原蛋白表達（0.75±0.08和0.62±0.11 vs 0.97±0.12），降低I/III型膠原比值（1.27和1.16 vs 1.39±0.20）。高劑量健心顆粒與苯那普利作用相似（p＞0.05）。

圖4 各組大鼠心房肌組織的Western blot分析l、lll型膠原的表達及定量分析。數據表示為均數±標準差，GAPDH作為內參蛋白，3次實驗產生相似的結果，如圖所示其中1次實驗的結果。*P＜0.05,與假手術組比較；#P＜0.05，與模型組比較。Collagen l:l型膠原，Collagen lll:lll型膠原。

三、討論

左房在整個心臟功能中起著重要作用。它既可作為“存儲器”，于左室收縮期存儲血液；亦可充當肺靜脈和左室之間的“管道”，在左室舒張早期輸送血液由肺靜脈進入左室；另外，左房作為“助力泵”，于舒張晚期主動收縮，增加左室充盈血量。左心房的存儲、管道、助力泵功能分別占左心室充盈容積的40%、35%和25%左右，左房通過這3個功能來共同協助左室充盈，維持心輸出量[9]。

本研究結果提示大鼠腹主動脈結扎12周后，出現室間隔增厚，左室射血分數降低、NT-pro BNP增高，左房擴大，SR-s、SR-a增高而SR-e降低。表明模型鼠出現了室壁肥厚、左心衰竭、左房重構、左房儲庫與輔泵功能增加而管道功能降低。左房功能紊亂的血流動力學機制可能為：心力衰竭時，由于左室舒張期充盈壓升高，左心室容量負荷逐漸加重，房室間壓差減小，從而導致舒張早期心室對心房的抽吸作用減低，左心房管道功能下降，后負荷增加；左房擴大，儲備功能增強。根據Frank-Starling定律，左心房擴大即左心房前負荷增加，心房肌收縮增強；另外，因左室收縮末容量和壓力增加，導致左房后負荷的增加亦使左心房纖維代償性收縮增強，因此輔泵功能增強。

目前，左房功能的無創性評估方法主要有斑點追蹤[10]、血流向量成像技術[11]、聲學定量技術等[12]。但用VVI技術評價左房功能，臨床較少見，亦無應用于動物實驗研究的文獻報道[13]。本團隊前期研究表明左心房的三大機械功能可以在應變率曲線上定量評估：正向波收縮峰值應變率反映儲庫功能，負向波舒張早期應變率反映管道功能，負向波舒張晚期應變率反映輔泵功能[14]。本實驗進一步證實速度向量成像可定量評價大鼠左房功能。本實驗發現：與假手術組比較，模型組SR-s（1.95±0.14 vs 0.96±0.07，P＜0.05）、SR-a增高（-1.32±0.19 vs -0.57±0.05，P＜0.05)，而SR-e降低（-0.36±0.05 vs -0.75±0.04，P＜0.05）。健心顆粒或苯那普利治療后，SR-s、SR-a降低而SR-e增加，說明健心顆粒或苯那普利可以降低心力衰竭大鼠左房儲庫與輔泵功能、增加管道功能。

腎素-血管緊張素系統（RAAS）參與心力衰竭的多種病理功能，如：心臟重構、心肌細胞凋亡、間質纖維化等[15]。血管緊張素轉化酶抑制劑苯那普利能降低血Ang II水平，抑制心肌細胞凋亡與間質纖維化。本實現表明，與模型組比較，苯那普利顯著降低血Ang II（328.93±42.09 vs 780.36±90.45，P＜0.05）水平，減少左房肌細胞凋亡數、降低CVF及Ⅰ、Ⅲ型膠原沉積。健心顆粒發揮與苯那普利類似的作用，可抑制血中Ang II水平，間接說明其作用機制可能與抑制RAAS系統有關。健心顆粒由黃芪、紅參、蒲黃、丹參、豬苓、白術、桂枝、葶藶子組成。以黃芪、紅參為君，益氣通陽以治其本；臣以生蒲黃、丹參活血化瘀，通利血脈；佐以豬苓、桂枝通陽化飲利水；澤瀉、葶藶子宣肺利水為使藥。現代醫學研究表明健心顆粒可以逆轉左室肥厚[16]，改善左室功能，降低血漿血管緊張素II水平，抑制左室心肌細胞凋亡[17]。本研究表明健心顆粒同樣可抑制左房肌凋亡與間質纖維化。

總之，VVI技術可無創定量評價大鼠左房功能；健心顆粒可改善心衰大鼠左房功能、減輕左房肌細胞凋亡與膠原沉積，本實驗從新的視角為健心顆粒治療心力衰竭提供了理論依據。但是，本實驗尚需擴大樣本量，進行進一步研究。