基于生物鐘基因的胃癌預后風險評估模型的建立

金悅，盧文卿，包博文，鄭雪瑩，佟笛，車曉芳

1 中國醫科大學附屬第一醫院，沈陽110001；2 遼寧省腫瘤藥物與生物治療重點實驗室；3 遼寧省惡性腫瘤臨床醫學研究中心

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，發病率、病死率高［1］，多數患者確診時已為晚期，預后較差［2］。因此，構建準確的預后預測模型對于評估胃癌患者預后、篩選預后不良的高危人群以盡早治療、提高生存率具有重要意義。晝夜節律是生命體以24 h 為周期的活動［3-4］，晝夜節律的產生是由多種生物鐘基因所調控的，包括CLOCK、PER1、PER2、PER3、CRY1、CRY2、TIMELESS、BMAL1、DEC1、DEC2、NPAS2和RORA 等。這些生物鐘基因在不同惡性腫瘤中發揮著不同的作用。生物鐘基因在胃癌中的研究較少，且大部分研究僅探索了生物鐘基因表達與胃癌的關系，對于多種生物鐘基因如何影響胃癌預后尚不明確。同時，因未綜合考慮所有生物鐘基因在胃癌中的作用，不能準確反映生物鐘基因對胃癌預后的影響［5］。因此，深入探討生物鐘基因與胃癌預后的關系、構建基于生物鐘基因的風險評估模型，對篩選高危患者、提高胃癌患者生存率具有重要意義。2019 年6 月—2020 年9 月，本研究利用美國國立生物技術信息中心（NCBI）中GES62254 數據集，分析上述12種主要的生物鐘基因對胃癌患者預后的影響，Cox 回歸分析篩選出生物鐘基因中影響胃癌患者生存的獨立預后因素，分析其與臨床病理參數的關系，構建了預測胃癌預后的風險評分模型，為實現胃癌的精準評估提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 數據資料來源 從NCBI 的GEO 數據庫（http：//www.ncbi.nlm.gov/geo/）下載GSE62254 數據集。排除缺失臨床病理資料的樣本，篩選出298例胃癌患者樣本。

1.2 不同生物鐘基因表達胃癌患者生存分析 根據298 例 胃 癌 患 者CLOCK、PER1、PER2、PER3、CRY1、CRY2、TIMELESS、BMAL1、DEC1、DEC2、NPAS2 和RORA 的表達情況，按照最佳cut-off 值分為高表達組和低表達組。采用Kaplan-Meier 法分析不同生物鐘基因高表達組和低表達組患者的總生存期（OS）。

1.3 影響胃癌患者生存時間的關鍵生物鐘基因篩選 采用Cox 單因素分析和多因素回歸分析篩選胃癌預后的獨立影響因素，將屬于獨立影響因素的生物鐘基因作為關鍵生物鐘基因。

1.4 關鍵生物鐘基因與胃癌臨床病理參數的相關性分析 采用χ2檢驗分析關鍵生物鐘基因與胃癌患者年齡、性別、浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期、腹膜轉移等臨床病理參數的關系。

1.5 基于生物鐘基因的胃癌預后風險評估模型的建立與驗證 建立胃癌預后風險（RS）評分公式RS=β1X1+β2X2+…+βnXn，其中β 為偏回歸系數，X 為獨立預后因素的賦值。繪制RS 評分預測胃癌預后的ROC 曲線，計算曲線下面積和約登指數最大時的敏感度和特異度。

2 結果

2.1 不同生物鐘基因表達胃癌患者生存分析結果 CLOCK、PER1、PER3、CRY2、NPAS2、RORA 高表達的胃癌患者OS 短于低表達者（P均＜0.05），TIMELESS 高表達者OS 長于低表達者（P=0.012）。PER2、CRY1、BMAL1、DEC1、DEC2 表達與胃癌患者OS無關（P均＞0.05）。詳見表1。

2.2 影響胃癌患者OS 的關鍵生物鐘基因 Cox 單因素分析顯示，CLOCK、PER1、PER3、CRY2、TIME?LESS、NPAS2和RORA是影響胃癌患者OS的因素（P均＜0.05）。將以上7 個因素納入Cox 多因素回歸分析，結果顯示PER1、CRY2和RORA是胃癌患者OS的獨立危險因素（P均＜0.05）。PER1、CRY2 和RORA 是影響胃癌患者OS的關鍵生物鐘基因。詳見表2。

表1 不同生物鐘基因高表達者和低表達者OS比較（月，）

表1 不同生物鐘基因高表達者和低表達者OS比較（月，）

注：與低表達者相比，*P＜0.05。

組別高表達者低表達者CLOCK 48.99 ± 2.65*51.97 ± 2.51 PER1 41.67 ± 2.46*59.76 ± 2.49 PER2 50.11 ± 2.16 51.24 ± 3.39 PER3 45.37 ± 2.70*54.52 ± 2.43 CRY1 49.07 ± 2.91 51.30 ± 2.34 CRY2 43.33 ± 2.49*59.21 ± 2.49組別高表達者低表達者RORA 43.44 ± 2.59*57.50 ± 2.44 TIMELESS 53.10 ± 2.42*47.83 ± 2.72 BMAL1 49.74 ± 3.16 50.86 ± 2.23 DEC1 51.74 ± 2.56 49.23 ± 2.60 DEC2 52.51 ± 2.59 48.43 ± 2.57 NPAS2 45.96 ± 2.65*54.98 ± 2.47

表2 影響胃癌患者OS的生物鐘基因分析結果

2.3 關鍵生物鐘基因表達與胃癌臨床病理參數的相關性 PER1 高表達與低齡（＜65 歲）、浸潤深度較深（T3～4）、TNM 分期較晚（Ⅲ+Ⅳ期）、腹膜轉移有關（P均＜0.05）。CRY2 高表達與浸潤深度較深、TNM分期較晚、淋巴結轉移、腹膜轉移有關（P均＜0.05）。RORA 高表達與低齡、浸潤深度較深、TNM 分期較晚、淋巴結轉移、遠處轉移、腹膜轉移有關（P均＜0.05）。見表3。

表3 PER1、CRY2、RORA表達與胃癌臨床病理參數的相關性（例）

2.4 基于生物鐘基因的RS評估模型應用效能 利用Cox 單因素回歸分析性別、年齡、浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移、腹膜轉移等臨床病理參數及PER1、CRY2、RORA 表達對胃癌患者預后的影響，結果顯示，浸潤深度深、淋巴結轉移、遠處轉移、腹膜轉移和PER1、CRY2、RORA 高表達是影響胃癌預后的危險因素（P均＜0.05）。Cox 多因素回歸分析結果顯示，淋巴結轉移、遠處轉移、腹膜轉移和PER1 高表達是影響胃癌預后的獨立危險因素（P均＜0.05）。見表4。根據公式RS=0.692×淋巴結轉移+0.747×遠端轉移+1.013×腹膜轉移+0.638×PER1 表 達 建 立RS 評 估 模 型。 計 算GSE62254 數據集中298 例樣本的RS 評分，根據RS 評分中位數分為高風險組和低風險組，進行Kaplan-Meier 生存分析，結果顯示，高風險組胃癌患者的OS 短于低風險組［分別為（31.38 ± 2.48）、（62.63 ± 2.09）月］。繪制RS 評分預測胃癌預后的ROC 曲線，ROC 曲線下面積為0.817，約登指數最大時RS 評分的敏感度為0.642、特異度為0.899（圖1）。

表4 胃癌患者預后影響因素的單因素和多因素回歸分析結果

圖1 RS評分預測胃癌預后的ROC曲線

3 討論

本研究利用NCBI 中GSE62254 數據集分析12種生物鐘基因對胃癌預后的影響，發現PER1、CRY2、RORA 是生物鐘基因中影響胃癌預后的獨立危險因素；構建的包含PER1 表達、淋巴結轉移、遠端轉移和腹膜轉移等臨床病理參數的風險評估模型對胃癌預后具有較好的預測效能。

哺乳動物的生物鐘基因廣泛分布于多種組織和器官中，通過形成轉錄和翻譯反饋環來調節晝夜節律。CLOCK 與BMAL1 形成異二聚體，作為轉錄因子激活PERs、CRYs 和RORA 等，從而形成正反饋環；與此同時，PERs 和CRYs 形成寡聚體，通過結合CLOCK/BMAL1 抑制CLOCK/BMAL1 轉錄，形成負反饋環，調節晝夜節律［6-9］。越來越多的研究證明，生物鐘基因在多種腫瘤的發生發展過程中發揮了重要作用［10-11］。有研究顯示，與正常乳腺組織相比，乳腺癌組織中PER1、PER2、PER3 及CRY2 低表達，而CLOCK、TIMELESS 高表達，且隨著TNM 分期增加，CRY1 表達逐漸降低［12］。還有研究發現，過表達PER2 能夠通過激活自噬通路抑制食管癌進展［13］；BMAL1 可通過上調MMP9 表達促進乳腺癌侵襲和轉移［14］。因此，探究多種生物鐘基因在腫瘤中的作用有重要意義。本研究Cox 單因素和多因素分析結果顯示，PER1、CRY2和RORA 是影響胃癌預后的獨立危險因素。DING 等［15］研究顯示，PER1 在胃癌組織中高表達且PER1 高表達的患者OS 較短，這與本研究結果一致。關于CRY2 和RORA 在胃癌中的作用及對預后的影響目前尚不明確，仍需擴大樣本進行驗證。在此基礎上，本研究應用以上三種生物鐘基因聯合臨床病理參數進一步篩選胃癌的獨立預后因素，創新性地建立了PER1 聯合淋巴結轉移、遠端轉移、腹膜轉移等多種臨床病理參數的風險評估模型，該模型預測效能較好，同時也提示PER1 可能是生物鐘基因中影響胃癌預后的關鍵基因。

針對PER1 基因在腫瘤中的作用，目前研究結論不一致。SATO 等［16］研究發現，PER1 在牙齦癌中起抗凋亡作用。而HAN 等［17］認為PER1低表達能夠促進膽管癌的發展。還有研究表明，沉默PER1 能夠抑制口腔鱗狀細胞癌增殖，促進凋亡，同時調控其他多種生物鐘基因的表達［18］。由此可見，多種生物鐘基因在腫瘤發生發展中共同協調發揮作用，PER1在其中發揮主要作用，從而印證了本研究以PER1為核心構建預后評估模型的重要性。當然，我們仍需要應用大量胃癌樣本，驗證多種生物鐘基因表達及其與胃癌預后的關系，完善RS 評估模型的準確性；同時從分子水平進一步驗證PER1 促進胃癌進展的相關分子機制，為明確生物鐘基因在胃癌中的作用及靶向藥物開發提供新的方向和思路。

綜上所述，生物鐘基因PER1、CRY2和RORA與胃癌預后密切相關，基于PER1 聯合淋巴結轉移、遠端轉移、腹膜轉移等臨床病理參數構建的風險評估模型在預測胃癌預后方面有較好的應用效能，PER1也可能成為胃癌治療的新靶點。