抑郁癥小鼠海馬組織差異表達炎癥因子基因篩選及生物信息學分析

邵青，袁東亮，王娜，閻得勝，張曉紅，張輝，權偉

1 西安市精神衛生中心，西安710199；2 空軍軍醫大學；3 空軍軍醫大學唐都醫院

抑郁癥是一組癥狀群，包括情緒及情感紊亂，快感缺乏和精神運動癥狀，其發生發展機制復雜，具體分子機制仍不明確。既往對于抑郁癥的機制研究主要涉及下丘腦—垂體—腎上腺軸［1］、神經遞質系統［2］、神經營養因子［3］、神經可塑性過程［4］、神經免疫軸［5］及神經炎癥趨化因子［6］等。大量研究證實，炎癥紊亂是抑郁癥發病的免疫學基礎，也是抑郁癥免疫病理的主要特征［7］。越來越多的基礎研究結果也支持抑郁癥患者存在神經炎癥的特征性改變，主要表現為小膠質細胞激活，可伴有星形膠質細胞激活、趨化因子水平改變等［8］。有研究報道，抑郁癥患者神經炎癥與C 反應蛋白（CRP）、白細胞介素（IL）6 等有關［9］，但都缺乏確鑿的證據。2018 年1 月—2019 年12 月，本研究應用炎癥細胞因子與受體PCR 芯片，觀察小鼠海馬組織中84 個炎癥因子基因的差異表達情況，對差異表達基因進行生物信息學分析，為深入探討抑郁癥發病的炎癥機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要材料 C57小鼠12只，體質量23～25 g，雄性，由空軍軍醫大學實驗動物中心提供，使用許可證號為SCXK（陜）2014-001，生產許可證號為SCXK（陜）2014-002。PCR 儀（PTC-100）購自MJ公司。雜交爐（G2545A）、芯片掃描儀（G2565BA）購自Agilent 公司。分光光度計（ND1000）購自Nano?drop 公司。TRIzol 試劑購自Invitrogen 公司。氯仿、異丙醇及乙醇購自上海化學試劑有限公司。無RNA酶的水/糖原購自Ambion公司。

1.2 抑郁癥模型制作及海馬組織獲取 將12 只小鼠分為對照組和抑郁癥組，每組6 只。抑郁癥組參照ADZIC 等［12］的方法，通過慢性不可預知溫和應激模型（CUMS）制備小鼠抑郁癥模型，配合孤養。應激處理的多變性及不可預測性是模型制備成功的關鍵。對照組不造模。造模結束后，將兩組小鼠麻醉，斷頭取腦，剝開新鮮的腦膜后立即獲取皮層和海馬組織，用鑷子直接夾取海馬核團，放入液氮保存。

1.3 海馬組織中炎癥因子基因檢測及差異表達基因篩選 海馬組織勻漿，勻漿后加入TRIzol 試劑提取RNA。DNase Ⅰ消化RNA 樣品，去除其中可能含有的基因組DNA，對RNA進行純度和質量檢測。隨后進行cDNA 合成及實時定量PCR 反應。檢測84個炎癥因子基因（見表1），得到原始基因表達數據集。采用GeneSpring GX11.5.1 軟件分析基因芯片數據，獲取兩樣本信號強度比值（Cy3/Cy5，Ratio），將Ratio＞2 或＜0.5 作為有表達差異，＞2 為表達下調、＜0.5為表達上調。Volcano Plot 篩選差異表達基因，以log2|Fold Change|＞2 及校正P＜0.05 者作為差異表達基因。

1.4 差異表達炎癥因子基因的生物信息學分析基于KEGG 數據庫和Reactom 數據庫，使用Topp?gene（https：//toppgene.cchmc.org/）在線工具對差異基因進行聯合通路富集分析；基于GO 數據庫，使用R 軟件包clusterProfiler3.8.1 對差異表達基因進行GO生物過程（GO-BP）的富集分析，在結果篩選時使用BH 校正并篩選錯誤發現率（FDR），以FDR＜0.05的富集功能項作為最后結果。

1.5 目標差異表達基因篩選 通過對GO-BP 分析及KEGG 通路分析結果進行交集，篩選目標差異表達基因。

表1 待檢小鼠炎癥因子基因種類

2 結果

2.1 兩組炎癥因子基因表達情況 與對照組相比，抑郁癥組中差異表達的細胞因子基因有6 個，表達上調的3個基因分別為CXCL5、BMP2、IL10RA，表達下調的3個基因分別為CCL12、IL5、IL1A。

2.2 GO-BP分析結果 GO-BP分析結果顯示，差異表達基因主要參與白細胞遷移、白細胞趨化性及免疫系統過程等生物過程的調控。見表2。

表2 差異表達基因GO-BP富集分析結果

2.3 KEGG通路分析結果 KEGG通路分析結果顯示，差異表達基因主要參與細胞因子與細胞因子受體相互作用通路、趨化因子信號轉導通路及IL-17信號轉導通路等信號通路。見表3。

表3 差異表達基因KEGG通路分析結果

2.4 目標差異表達基因篩選結果 通過對GO-BP分析及KEGG 通路分析結果進行交集，篩選出4 個目標差異表達基因，為CXCL5、BMP2、IL1A、CCL12基因（倍數變化分別為2.68、2.21、0.47、0.36）。

3 討論

傳統觀念認為，由于血腦屏障的存在，中樞神經系統通常被視為“免疫豁免區”，但這一觀念在逐漸改變，因在中樞神經系統內也可出現炎癥介質水平增高［10］。研究發現，神經炎癥假說在抑郁癥病理機制中具有重要作用［11］。上述觀點亦通過腦影像學技術如正電子發射體層攝影（PET）得到驗證［12］。抑郁癥為炎癥因子紊亂，即促炎因子和抑制炎癥的因子都可能增加，這一特點與其他炎癥性疾病有所不同［13］。對抑郁癥神經炎癥的相關分子機制進行研究，有助于為未來開展抑郁癥的免疫靶向治療提供參考。

本研究采用的QIAGEN PCR 芯片具有兩個特點［14］：一是免除引物設計合成和PCR 條件的摸索，二是無需檢索文獻或前期的實驗驗證。小鼠炎癥因子與受體芯片包含84 個炎癥因子相關基因。涵蓋了趨化因子及其受體基因、IL 及其受體基因等。基因芯片結果顯示，抑郁癥組與對照組相比，表達差異的炎癥因子基因有6個，表達上調和下調的基因各3個。在抑郁癥的發病過程中有多個炎癥相關過程參與，它們涉及到白細胞遷移、白細胞趨化性及免疫系統等生物過程，也涉及細胞因子與細胞因子受體相互作用通路、趨化因子信號轉導通路及IL-17信號轉導通路等。這些結果再次證實了抑郁癥中多個炎癥相關基因改變的多樣性［15］。本研究共篩選出4個目標差異表達基因，分別為CXCL5、BMP2、IL1A、CCL12基因。推測它們與抑郁癥的炎癥作用機制高度相關，是引起本實驗中小鼠抑郁癥的主要差異靶基因，但具體調控機制還需進一步研究。

在4 個目標基因中，CXCL5 基因表達差異最為明顯。CXCL5 基因位于4 號染色體q13.3，編碼CX?CL5蛋白［16］。CXCL5為趨化因子CXC家族一員。趨化因子是一類小分子堿性蛋白，主要功能是趨化細胞定向移動。大多數的趨化因子屬于CC 和CXC 兩個亞族。CXC 亞族有17 個成員（CXCL1-17），CXC亞族主要作用于中性粒細胞，這個亞族中比較重要的趨化因子有IL-8（CXCL8）、γ干擾素誘生的單核因子（Mig/CXCL9）、γ 干擾素誘生蛋白10（IP-10/CX?CL10）、基質細胞來源因子1（SDF-1/CXCL12）等［17］。CXCL5 主要表達于中性粒細胞、單核細胞，也能表達于嗜酸性粒細胞。中性粒細胞是先天性免疫監視的重要組成部分，同時在炎癥導致的病理損傷中發揮重要作用［18］。有文獻顯示，CXCL5 信號通路與神經炎癥及血腦屏障損傷相關，并可導致腦白質損傷［19］。另有學者發現，CXCL5 與創傷性腦損傷［20］、人腦內皮屏障破壞［21］等相關。CXCL5 與抑郁癥的關系及其中相關機制還需要進一步驗證。