人參根提取物增強巨噬細胞RAW264.7的自噬水平并提高其增殖和吞噬能力

李芳宇，齊 濱，邊 帥，趙 月，盧姝言，遲 迅，王佳雯*

1長春中醫藥大學藥學院；2長春中醫藥大學人參科學研究院；3長春中醫藥大學科研處，長春 130117

巨噬細胞是機體重要的固有免疫細胞之一，具有吞噬、抗原呈遞、免疫防御和炎癥調節等多種功能[1]。巨噬細胞主要通過其表達的模式識別受體和病原體并激活相關分子，從而吞噬病原體。

自噬是一種維持機體穩態平衡的過程,能吞噬自身細胞質蛋白或細胞器并使其包被進入囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體,降解其所包裹的內容物,藉此實現細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新[2,3]。自噬在巨噬細胞吞噬、抗原呈遞、調節免疫應答和炎性反應過程中起重要作用[4]。巨噬細胞自噬功能下降會影響其吞噬功能。人參具有增強免疫力的作用，在特異性抗體形成、淋巴細胞增殖及巨噬細胞吞噬能力增強等多方面均有所體現[5]。故本文選用人參根提取物作用于巨噬細胞RAW264.7，探究其對巨噬細胞的自噬水平、增殖能力及吞噬能力影響，為人參根提取物的深入研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器

Infinite 200 Pro酶標儀(瑞士，TECAN公司)；111型二氧化碳培養箱(美國，Thermo公司)；熒光顯微鏡IX73(日本，Lympus公司)；1645050型蛋白質凝膠電泳儀(美國，Bio-Rad公司)；iBright智能成像系統 FL1000(中國，Invitrogen公司)。

1.2 藥品與試劑

人參藥材采購自吉林撫松(采摘時間為2018年9月20日)，由長春中醫藥大學藥學院肖井雷副教授鑒定為五加科人參屬植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根；DMEM(美國HyClone公司)；BS緩沖液(美國Hyclone)；胎牛血清(美國GIBCO公司)；CCK-8試劑盒(美國BOSTER)；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，美國Sigma)；中性紅試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術公司)；吖啶橙(AO，索萊寶)；AKT、p-AKT、AMPK、p-AMPK、m-TOR、p-mTOR、ULK1、p-ULK1、β-actin兔多克隆抗體(上海Bioword)；ATG7、LC3B兔單克隆抗體(美國CST公司)；自噬誘導劑rapamycin、自噬抑制劑CQ試劑(美國MCE公司)。

1.3 方法

1.3.1 人參根提取物制備

精密稱取人參50 g，粉碎，過篩(80目)，料液比1∶10，40 ℃水浴超聲提取2 h，提取液離心過濾，超濾濃縮；殘渣加水料液比1∶10，升溫至80 ℃提取1.5 h，提取液超濾濃縮，濃縮液分別凍干，備用。人參根提取物收率為21.58%。

1.3.2 細胞培養

將巨噬細胞RAW264.7于高糖DMEM完全培養液中(含有10% FBS、1%的鏈霉素和青霉素)，置于37 ℃、含5% CO2的培養箱內培養。選擇對數生長期細胞用于實驗。

1.3.3 CCK8細胞增殖實驗

前期經過設置一系列濃度梯度確定了人參根提取物在0～500 μg/mL濃度范圍內對巨噬細胞RAW264.7無毒性，且能夠通過濃度梯度依賴性的方式提高細胞活性(數據未顯示)。因此本實驗選用32、125、500 μg/mL三個濃度作為低中高劑量進行研究。

選取對數生長期細胞，按1×105個/mL，100 μL/孔接種于96孔板中，于37 ℃、含5% CO2的培養箱內培養24 h后棄去培養液，加入質量濃度分別為(32、125、500 μg/mL)的人參根提取物，同時設置空白對照組(完全培養液、細胞)和1 μg/mL的LPS陽性對照組；培養24 h后每孔加入10 μL的CCK8于培養箱中繼續孵育40 min，用酶標儀在490 nm出測定吸光值，實驗重復3次，計算細胞的相對存活率。

相對細胞存活率=[(實驗組孔吸光值-空白組孔吸光值)/(對照組孔吸光值-空白組孔吸光值)]

×100%

1.3.4 中性紅吞噬實驗

將密度為1×105個/mL細胞接種于96孔板中，每孔100 μL于CO2的培養箱內培養24 h后棄去培養液，加入質量濃度分別為(32、125、500 μg/mL)的人參根提取物，同時設置空白對照組(完全培養液、細胞)和1 μg/mL的LPS陽性對照組；培養24 h后，吸出上清液，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌2次，每孔加入培養液200 μL和中性紅染液20 μL，于培養箱內繼續孵育3 h；棄除上清液，再用PBS洗滌2次，每孔加入200 μL裂解液，室溫搖床裂解10 min，用酶標儀在540 nm波長處測定A值，實驗重復3次，按公式計算吞噬指數。

吞噬指數=實驗組A540nm/空白對照組A540nm

1.3.5 AO染色實驗

將密度為1×105個/mL細胞接種于6孔板中，每孔2 mL于CO2的培養箱內培養24 h后棄去培養液，加入質量濃度分別為(32、125、500 μg/mL)的人參根提取物，同時設置空白對照組(完全培養液、細胞)和500 nM的rapamycin陽性對照組；培養24 h后，吸出上清液，PBS緩沖溶液洗3次，4%多聚甲醛室溫固定10 min，棄上清，PBS緩沖溶液洗3次，加入終濃度為15 μg/mL的AO，室溫避光孵育15 min，棄上清，PBS緩沖溶液洗3次，實驗重復3次，在熒光顯微鏡下觀察細胞的形態并照相。

1.3.6 Western blot檢測RAW264.7 細胞因子的蛋白表達

將密度為1×105個/mL細胞接種于6孔板中，每孔2 mL于CO2的培養箱內培養24 h后棄去培養液，加入質量濃度分別為(32、125、500 μg/mL)的人參根提取物，同時設置空白對照組(完全培養液、細胞)，培養24 h后，收集細胞，離心(1 000 rpm，5 min)，棄上清，PBS緩沖溶液洗3次，加入細胞裂解液。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測蛋白濃度。電泳分離，轉膜(NC膜)、封閉30 min后，一抗孵育4 ℃過夜，回收一抗，PBST洗3次，二抗室溫孵育1 h，實驗重復3次，進行顯色觀察條帶。

1.3.7 自噬對細胞增殖及吞噬能力影響檢測實驗

將密度為1×105個/mL細胞接種于96孔板中，每孔100 μL于CO2的培養箱內培養24 h后棄去培養液，設置空白對照組(完全培養液、細胞)、單獨給藥組125 μg/mL人參根提取物、500 nM的rapamycin和125 μg/mL人參根提取物共同給藥組、50 μM的CQ和125 μg/mL人參根提取物共同給藥組；500 nM rapamycin組、50 μM CQ組，培養24 h后，分別按照“1.3.3”與“1.3.4”實驗方法進行檢測。

1.3.8 統計學方法

2 結果

2.1 巨噬細胞RAW264.7增殖率檢測

由圖1可知，與對照組比較，人參根提取物濃度為(32、125、500 μg/mL)和LPS陽性組均能提高巨噬細胞RAW264.7的增殖率(P<0.05，P<0.01)，由此可見人參根提取物可直接刺激巨噬細胞RAW264.7增殖。

圖1 人參根提取物對巨噬細胞RAW264.7增殖的影響Fig.1 Effect of Ginseng root extract on RAW264.7 proliferation of macrophages )注：A：空白對照組；B：32 μg/mL人參根提取物；C：125 μg/mL人參根提取物；D：500 μg/mL人參根提取物；E：陽性對照組。與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。下同。Note:A:Blank control group;B:32 μg/mL ginseng root extract;C:125 μg/mL ginseng root extract;D:500 μg/mL ginseng root extract;E:Positive control group.Compared with the blank group,*P <0.05,**P <0.01.The same below.

圖2 人參根提取物對巨噬細胞RAW264.7吞噬活性的影響Fig.2 Effect of ginseng root extract on macrophage

2.2 巨噬細胞RAW264.7吞噬活性檢測

由圖2可知，與空白對照組相比，當人參根提取物濃度為32 μg/mL時，人參根提取物對巨噬細胞RAW264.7吞噬活性的影響無統計學意義。當人參根提取物濃度為125、500 μg/mL時則可提高巨噬細胞的吞噬活性，且與對照組相比具有顯著性差異(P<0.01)，該結果表明，一定濃度的人參根提取物可提高巨噬細胞RAW264.7吞噬能力。

2.3 巨噬細胞RAW264.7中酸性囊泡的水平檢測

AO染色被認為是標記自噬溶酶體的特異性方法，當自噬水平較低時，主要觀察到綠色熒光；當自噬水平升高時，紅色熒光將增強。由圖3可知，與空白對照相比，隨著人參根提取物濃度的增加，合并后的熒光顏色由綠色逐漸過渡到黃色，說明自噬水平升高。

圖3 人參根提取物對巨噬細胞RAW264.7中自噬體數量的影響(×20)Fig.3 Effect of ginseng root extract on the number of autophagosomes in RAW264.7(×20)

2.4 巨噬細胞RAW264.7自噬相關蛋白的表達

由圖4可知，與空白對照組相比，125、500 μg/mL人參根提取物組巨噬細胞RAW264.7中ATG7和p-ULK1的表達提高、LC3B I向LC3B II的轉化增加，進一步說明自噬被誘導。同時p-AMPK蛋白表達明顯升高，而p-mTOR和p-AKT表達降低，具有統計學差異(P<0.05，P<0.01)。說明人參根提取物通過促進自噬相關蛋白的增加并激活AMPK /mTOR和AKT/mTOR信號通路，誘導巨噬細胞RAW264.7發生自噬。

圖4 人參根提取物對巨噬細胞RAW264.7中自噬相關蛋白表達的影響Fig.4 Effect of ginseng root extract on autophagy-related protein expression in macrophage

2.5 自噬抑制劑中和了人參根提取物對巨噬細胞RAW264.7增殖以及吞噬活性的增強作用

由圖5、6可知，與空白對照組相比，單獨給藥組(人參根提取物濃度為125 μg/mL)和單獨加入自噬誘導劑(rapamycin)組可增強巨噬細胞RAW264.7增殖以及吞噬能力增強(P<0.01)，單獨加入自噬抑制劑(CQ)組則降低可巨噬細胞RAW264.7增殖以及吞噬能力(P<0.05)；與單獨給藥組相比，rapamycin與人參根提取物共處理可增強巨噬細胞RAW264.7增殖以及吞噬能力(P<0.01)；與單獨給藥組相比，人參根提取物與自噬抑制劑(CQ)共處理后，巨噬細胞RAW264.7的增殖以及吞噬能力明顯降低(P<0.05，P<0.01)。由此可見，人參根提取物可能通過增強巨噬細胞RAW264.7的自噬水平，提高細胞的增殖以及吞噬能力。

圖5 自噬抑制劑中和了人參根提取物對巨噬細胞RAW264.7增殖的影響Fig.5 Effect of ginseng root extract on RAW264.7 proliferation of macrophages neutralized by 注：F：125 μg/mL人參根提取物+rapamycin；G：125 μg/mL人參根提取物+CQ；H：Rapamycin；I：CQ，下同。Note:F:125 μg/mL ginseng root extract +rapamycin;G:125 μg/mL ginseng root extract +CQ;H:Rapamycin;I:CQ,the same below.

圖6 自噬抑制劑中和了人參根提取物對巨噬細胞RAW264.7吞噬活性的增強作用Fig.6 Autophagy inhibitors neutralize ginseng root extract against macrophage RAW264.7 enhancement

3 討論

增殖是免疫細胞分化成多種功能表型并在免疫應答中發揮相應作用的前提與基礎，吞噬作用則是巨噬細胞等吞噬細胞清除外源性病原微生物和內源性衰老和死亡細胞的重要手段[6]。在本研究中，一定質量濃度的人參根提取物能夠顯著促進巨噬細胞增殖，增強其吞噬能力，表明人參根提取物能夠通過促進巨噬細胞的增殖，以及提高巨噬細胞的吞噬能力，從而達到免疫調節作用。

自噬是一種保守的細胞降解途徑。自噬利用溶酶體降解自身受損細胞器及大分子物質,其產生的氨基酸和小分子物質被重新利用,從而實現胞內物質循環和內環境平衡[7]。自噬形成時，胞漿型LC3會酶解一小段多肽形成LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ與PE結合形成(自噬體)膜型(即LC3-Ⅱ)[8]，因此，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的大小可估計自噬水平的高低，當哺乳動物細胞發生自噬時，細胞內LC3的含量及LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉化明顯增強。自噬相關蛋白7(autophagy related protein7，Atg7)在自噬過程中可以促進自噬性溶酶體的形成和受損線粒體的分解[9]。

AMPK /mTOR與Akt/mTOR是兩條經典的自噬信號通路[10,11]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是一種絲/蘇氨酸激酶，其活化(磷酸化)后可抑制mTOR活性，提高細胞自噬水平[12]。蛋白激酶B(Akt或稱PKB)同樣也是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，其可協同磷脂酰肌醇依賴性蛋白激酶1/2促進三磷酸磷脂酰肌醇與其自身結合，Akt由胞漿轉移至質膜并發生活化(磷酸化)，Akt活化后可激活下游蛋白mTOR(使其磷酸化)，從而抑制自噬的進程[11]。

研究結果顯示，巨噬細胞RAW264.7中Atg7、LC3蛋白表達量增加，p-AKT、p-mTOR表達減少，AMPK磷酸化水平增加，與對照組比較差異均具有統計學意義。說明人參根提取物通過多種途徑參與調解巨噬細胞RAW264.7的自噬反應。 自噬在巨噬細胞行使功能過程中具有重要作用。通過自噬調節劑調節自噬水平，可以增強或中和人參根提取物對巨噬細胞RAW264.7功能的影響。

綜上所述，人參根提取物能夠促進巨噬細胞RAW264.7增殖，增強其吞噬功能，通過AMPK/mTOR和AKT/mTOR信號通路，提高巨噬細胞RAW264.7的自噬水平，兩者具有相關性。本研究為人參根提取物在細胞自噬、免疫調節中的應用提供了一定的理論依據，但其作用的分子機制仍有待進行深入研究。