基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究參附注射液治療心肌頓抑的作用機制*

賈 思 鄧海霞 吳瑞華 陀 鵬

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530022；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧530022）

心肌頓抑是心肌經(jīng)歷短暫的缺血后心臟功能延遲恢復(fù)的一種可逆性損傷，表現(xiàn)為心肌收縮能力的減弱，心臟排血量降低、射血分數(shù)減少等［1］，可發(fā)生在心臟驟停心肺復(fù)蘇后、心臟移植、應(yīng)激性心肌病、心臟介入術(shù)后、心絞痛等缺血性心肌疾病中［2］。雖然發(fā)生心肌頓抑的心肌細胞并未發(fā)生壞死，但是可能會引起缺血后左室功能障礙、血流動力學(xué)不穩(wěn)定等現(xiàn)象，甚至?xí)?dǎo)致心力衰竭、肺水腫、猝死等嚴重并發(fā)癥，從而增加病死率［3］。因此如何有效防治心肌頓抑，已經(jīng)成為臨床上亟待解決的問題。心肌頓抑屬于中醫(yī)“胸痹”“心悸”等范疇，基本治法為袪邪治標、活血化瘀、辛溫通陽、瀉濁豁痰、溫陽補氣、益氣養(yǎng)陰、滋陰益腎等。中醫(yī)藥具有多成分、多途徑、多靶點的特性，在防治心血管疾病中有獨特優(yōu)勢。

參附注射液組分為人參和附子，具有回陽救逆、穩(wěn)固營衛(wèi)之功效，主要有效成分有人參皂苷和烏頭類生物堿，可強心、利尿、擴張冠狀動脈血管，同時還能減少心肌耗氧量并降低心臟負荷，主要用于休克、心律失常、心力衰竭等屬陽氣暴脫證者［4-5］。目前對于參附注射液的研究局限于單一的通路機制，對其系統(tǒng)的作用機制研究尚不全面。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從分子層面系統(tǒng)地分析參附注射液有效成分的作用靶點、生物過程、信號通路等在心肌頓抑中的作用機制。以期為深入研究參附注射液治療心肌頓抑的基礎(chǔ)實驗研究及臨床合理應(yīng)用奠定基礎(chǔ)并提供新思路。

1 材料與方法

1.1 參附注射液有效化合物的收集與篩選 參附注射液由人參和附子提取而成。利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18為篩選條件，收集這兩個藥物的有效化合物。

1.2 參附注射液有效化合物的靶點預(yù)測 將收集到的參附注射液有效化合物以Mol2格式上傳到Pharm?mapper服務(wù)器中，選擇藥效團模型，將返回靶點數(shù)設(shè)置為300，得到參附注射液化合物的有效靶點。并將預(yù)測出的靶點導(dǎo)入Uniprot數(shù)據(jù)庫獲得標準基因名。

1.3 化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 選取人參和附子化合物成分前10個靶點，將化合物及相應(yīng)靶點信息上傳到Cytoscape軟件中構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖并進行可視化分析，以“節(jié)點”代表成分和靶點，“邊”代表成分與靶點之間的相互作用，獲得化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.4 心肌頓抑相關(guān)靶點的預(yù)測 利用在線文本挖掘服務(wù)器 GeneCards（https：//www.genecards.org/）、人類孟德爾遺傳OMIM 數(shù)據(jù)庫（http：//www.omim.org/）和CTD（http：//ctdbase.org/）數(shù)據(jù)庫篩選出與心肌頓抑相關(guān)的靶點，以“stunned myocardium”為關(guān)鍵詞進行檢索，收集并整合與心肌頓抑相關(guān)的靶點。

1.5 參附注射液對心肌頓抑的作用靶點預(yù)測 將參附注射液化合物靶點和心肌頓抑相關(guān)靶點導(dǎo)入Venny在線分析軟件中，得到參附注射液對心肌頓抑的26個潛在治療靶點。將這26個靶點上傳到SRTING（http：//string-db.org）數(shù)據(jù)庫中，選擇物種為“Homo sa?piens”，設(shè)置靶點之間相互作用值為0.4，得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，并保存為TSV格式。將所得的TSV格式的文件導(dǎo)入Cytoscape軟件進行可視化分析獲得蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 網(wǎng)絡(luò)合并 通過Cytoscape軟件中的Merge功能，對參附注射液化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)與參附注射液對心肌頓抑的作用靶點進行合并，構(gòu)建藥物-成分-靶點-疾病全局性網(wǎng)絡(luò)。

1.7 參附注射液對心肌頓抑作用靶點的富集分析和KEGG通路注釋分析 將“1.5”所得到的交集靶點導(dǎo)入DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫中，進行GO分析和KEGG分析，在分析結(jié)果中收集生物過程（BP）、分子功能（MF）、細胞成分（CC）和The Kyoto En-cyclope?dia of Genes and Genomes（KEGG）通路富集分析并保存。利用微生信在線網(wǎng)站（http：//www.bioinformatics.com.cn/）將KEGG通路繪制成氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 參附注射液有效化合物的收集 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為條件，收集到符合條件的43個化合物，其中人參22個，附子21個。化合物包括豆甾醇（stigmasterol）、山柰酚（kaempferol）、β-谷固醇（beta-sitosterol）、人參皂苷Rh2（ginsenoside rh2）等，各化合物的具體信息見表1。

2.2 參附注射液化學(xué)成分靶點預(yù)測及相互作用 在PharmMapper服務(wù)器中預(yù)測表1篩選出的43個參附注射液有效化合物，取結(jié)果中每個化學(xué)成分的前10個蛋白，隨后上傳到Uiprot數(shù)據(jù)庫，獲得統(tǒng)一基因名。再將這些蛋白上傳到SRTING在線軟件中，對重復(fù)蛋白和非人源蛋白進行剔除，最后獲得74個靶點。將結(jié)果中的靶點蛋白導(dǎo)入到Cytoscape軟件中，構(gòu)建“靶點蛋白相互作用”網(wǎng)絡(luò)圖（圖1）和“化合物-成分靶點”網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）。

圖1 參附注射液化學(xué)成分靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 參附注射液化合物成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖

表1 參附注射液化合物成分

2.3 參附注射液對心肌頓抑作用靶點 通過Gene?Cards、OMIM和CTD數(shù)據(jù)庫，以“stunned myocardium”為檢索詞，共整合到1 826個疾病靶點。將參附注射液化合物靶點和心肌頓抑作用機制相關(guān)靶點上傳到Ven?ny在線分析軟件中，分析得出26個交集靶點，見圖3。

圖3 參附注射液化學(xué)成分靶點與心肌頓抑相關(guān)疾病靶點Venny圖

2.4 參附注射液對心肌頓抑作用靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將“2.3”所獲得的26個交集靶點上傳到STRING在線軟件中，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)并保存TSV格式文件。在Cytoscape軟件中導(dǎo)入TSV文件，獲得蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，見圖4。參附注射液對心肌頓抑作用的潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò)有23個節(jié)點（去除3個無相互作用的靶點），包括半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（CASP3）、表皮生長因子受體（EGFR）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、雌激素受體1（ESR1）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶7（CASP7）、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶P1（GSTP1）等。

圖4 參附注射液對心肌頓抑作用靶點的蛋白互作圖

2.5 參附注射液對心肌頓抑靶點的全局性網(wǎng)絡(luò)分析 利用Cytoscape軟件中的Merge功能將參附注射液化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)和參附注射液對心肌頓抑作用靶點PPI網(wǎng)絡(luò)合成全局性蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。見圖5。

圖5 參附注射液與心肌頓抑靶點全局性網(wǎng)絡(luò)

2.6 參附注射液對心肌頓抑作用靶點的GO分析和KEGG富集分析 在DAVID數(shù)據(jù)庫中進行GO分析，以P＜0.05為條件進行篩選，獲得55個生物學(xué)過程（BP），包括：序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)控、凋亡過程負調(diào)控、應(yīng)激反應(yīng)、細胞對脂多糖的反應(yīng)、成纖維細胞增殖的正調(diào)控等；15個細胞組成（CC），包括：核質(zhì)、胞質(zhì)、細胞核、線粒體、外泌體等；20個分子功能（MF），包括：絲裂原活化蛋白激酶活性、酶結(jié)合、蛋白結(jié)合、ATP結(jié)合、蛋白激酶活性等。GO分析見圖6（圖中BP和MF按P值選擇前15個）。在KEGG通路富集分析結(jié)果中，篩選出P＜0.05以及與心肌頓抑直接或間接相關(guān)的通路共12條，包括TNF信號通路（TNF sig?naling pathway）、Foxo信號通路（FoxO signaling path?way）、NOD樣受體信號通路（NOD-like receptor signal?ing pathway）、MAPK 信號通路（MAPK signaling path?way）、Toll樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）等，具體KEGG通路富集分析氣泡圖見圖7。

圖6 參附注射液對心肌頓抑作用靶點的BP、CC、MF分析

圖7 參附注射液對心肌頓抑作用的KEGG氣泡圖

3 討論

心肌頓抑是短暫、可逆的心肌缺血所引發(fā)的心肌功能障礙，常見于心肌梗死、心絞痛、心臟驟停心肺復(fù)蘇后、心臟移植等缺血性損傷中［6］。心肌頓抑的發(fā)生可能會導(dǎo)致嚴重的并發(fā)癥，如心力衰竭、惡性心律失常、猝死等，增加患者的死亡率。然而在臨床上，尚未出現(xiàn)確切的心肌頓抑治療指南，沒有加速恢復(fù)心肌功能障礙的治療方法［7］。大量研究證實中醫(yī)藥在防治心血管疾病方面具有獨特的優(yōu)勢［8］，它可以從多靶點、多成分、多通路系統(tǒng)地對心肌頓抑的發(fā)生發(fā)展進行干預(yù)。參附注射液是防治心血管疾病的常用中成藥，在臨床研究及實驗研究中均證實其具有顯著療效［9］。

本研究通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出43個有效化合物，包括山柰酚（kaempferol）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、人參皂苷Rh2（ginsenoside rh2）等。有研究表明［10-12］，這些成分對損傷的心肌細胞具有修復(fù)作用。這些化合物都與心肌頓抑的機制相關(guān)，由此我們推測參附注射液可通過這些化合物共同作用于心肌頓抑，發(fā)揮保護性作用。

本研究中獲得26個參附注射液對心肌頓抑的潛在治療靶點，去除掉3個無交互作用的靶點，最終得到23個潛在靶點，故我們推測參附注射液可能通過這23個靶點對心肌頓抑發(fā)揮作用，分析發(fā)現(xiàn)這些靶點共同參與多種生物過程，如EGFR、CASP3、MAPK8和GSTP共同參與凋亡過程的負調(diào)控，EGFR、MAPK1、MAPK8共同參與應(yīng)激反應(yīng)，MAPK14、MAPK8和GSTP1共同參與細胞對脂多糖的反應(yīng)。CASP3是參與細胞凋亡的重要組成部分，對機體的凋亡過程有著重要的調(diào)節(jié)作用；EGFR是上皮生長因子細胞增殖和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體，與細胞的增殖、分化、血管生成、細胞凋亡的抑制等過程相關(guān)［13］；絲裂原活化蛋白激酶MAPK1、MAPK8和MAPK14是信號從細胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細胞核內(nèi)的重要介質(zhì)，調(diào)節(jié)細胞的生長、分化、炎癥反應(yīng)等多種重要的細胞病理生理過程［14］。這些生物學(xué)過程與心肌頓抑的發(fā)生機制都存在相互關(guān)系，因此我們推測參附注射液可能通過共同誘導(dǎo)這些基因的表達對心肌發(fā)揮保護性作用。

在KEGG分析中，篩選得到12條信號通路，其中與心肌頓抑密切相關(guān)的通路有Toll樣受體信號通路（TLRs）、Foxo信號通路、NOD樣受體信號通路（NOD-like receptor signaling pathway）。TLRs是介導(dǎo)人體內(nèi)先天免疫和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵信號通路［15］。TLRs可通過激活絲裂原活化蛋白激酶和核因子κB（NF-κB）信號級聯(lián)途徑，促進下游炎性因子的表達，如白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子（TNF）-α等，從而引起心肌細胞的損傷［16］。Han等［17］研究發(fā)現(xiàn)TLR4-NF-κB通路活化后可使心肌梗死大鼠心肌中的炎癥標志物顯著增加。而在使用藥物對TLR4-NF-κB通路進行抑制后，發(fā)現(xiàn)大鼠體內(nèi)心肌壞死標志物及炎癥因子均明顯降低，心功能得到改善［18］。

張弛等的實驗研究證實，參附注射液可以通過抑制TLR4/NF-κB信號通路來抑制脂多糖介導(dǎo)的黏附分子表達，進而減輕機體的炎癥反應(yīng)［19］。Foxo蛋白參與多種生物學(xué)過程，包括抗氧化應(yīng)激反應(yīng)、抗凋亡等，可減少心肌誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細胞凋亡，通過增加抗氧化劑的產(chǎn)生和細胞存活對缺血的心肌發(fā)揮保護作用［20］。Fox家族包含17個亞族，其中Foxo1和Foxo3主要在心臟組織中表達［21］。Sengupta A等［22］在實驗研究中指出，心肌細胞中Foxo1和Foxo3共同缺失會導(dǎo)致抗氧化劑和DNA修復(fù)酶減少，從而加重心肌的損傷。NOD樣受體信號通路（NLRs）廣泛存在于人體細胞質(zhì)中，其在機體固有免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［23］。NLPs通過激活NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制炎性因子的激活。Li H等［24］研究證實NRLs主要通過抑制心肌缺血引起的炎癥反應(yīng)和細胞凋亡，在心臟中起保護作用。因此我們推測，參附注射液有效活性成分可能是通過調(diào)控各大代謝通路，共同發(fā)揮保護心肌頓抑中心肌細胞的作用。

綜上所述，本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)層面初步預(yù)測了參附注射液治療心肌頓抑的有效活性成分、潛在作用靶點、關(guān)鍵信號通路等復(fù)雜的機制，為參附注射液的藥理作用提供了理論基礎(chǔ)和新的思路。然而，本研究仍存在一定的局限性，單從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)層面預(yù)測了參附注射液對心肌頓抑的作用機制，還需通過臨床及實驗方面的研究進一步證實。因此本研究后期還需要大量的實驗研究加以佐證。