妊娠期鉛、鎘暴露對新生大鼠海馬BDNF及ZnT7蛋白表達的影響*

路艷清，孫 蕾，王雪芳

(1.甘肅省蘭州市第二人民醫院婦產科 730046;2.甘肅省武威市人民醫院婦產科 733000)

隨著工業化和城市化進程的加快，環境鉛(plumbum，Pb)、鎘(cadmium，Cd)污染對人體健康尤其是兒童生長發育及智力、行為健康的影響已成為社會關注問題之一[1-2]。Pb是一種具有神經毒性的重金屬，Cd也是一種廣泛存在于工農業和日常生活中的重金屬類環境污染物，其環境含量呈逐年上升趨勢，可毒害女性生殖系統、發育中的神經系統及小兒體格和神經發育[3]。以往研究證實，母體血Pb、Cd與臍血Pb、Cd有一定相關性[4]，但關于妊娠期暴露Pb、Cd對新生兒的作用機制尚不完全清楚。腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)在神經系統、內分泌系統等廣泛表達，對神經元的生長、發育、分化及再生具有維持和促進作用[5-6]。鋅在中樞神經系統中水平豐富，其穩態對維持腦正常生理功能起重要作用，其水平變化與鋅轉移體(Zinc transporter，ZnT)直接相關[7]。因此本研究擬通過對母鼠妊娠期Pb、Cd暴露進行研究，旨在探究其對新生大鼠海馬中BDNF及ZnT7蛋白表達的影響，以期為Pb、Cd的神經毒性作用機制及臨床預防和治療Pb、Cd毒性損傷提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

12只健康清潔級妊娠SD大鼠由廣東省醫學實驗動物中心提供，分成4組：對照組(NC組，飲用蒸餾水)、鉛組(Pb組，300 mg/L)、鎘組(Cd組，10 mg/L)及鉛鎘聯合組(Pb+Cd組，300 mg/L+10 mg/L)，每組3只。均維持12 h光照/12 h黑暗循環，環境溫度22～24 ℃，濕度45%～65%，自由采食，均從妊娠第1天至妊娠結束共飲水染毒21 d。動物的飼養和使用均符合美國國立衛生研究院指南及動物倫理保護有關準則。

1.2 主要試劑及儀器

醋酸鉛(546-67-8)購自上海一基實業有限公司；醋酸鎘(15280-53-2)購自湖北巨勝科技有限公司；蛋白抽提試劑盒(P0028)、BCA蛋白定量試劑盒(P0010S)購自上海碧云天有限公司；一抗兔源抗BDNF(ab108319)、抗ZnT7蛋白(ab223065)、抗GAPDH(ab181602)抗體購自英國Abcam公司等；FC酶標儀購自美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1采樣

每組選取16只21 d齡新生大鼠(每窩取5～6只)腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉處死，采集各組新生大鼠腹主動脈血2 mL于肝素鋰抗凝真空管中，置于-80 ℃冰箱保存備用。斷頭取腦部海馬組織后迅速置于液氮中保存待用。

1.3.2新生大鼠認知能力評定

采樣前采用水迷宮實驗測定新生大鼠認知能力。水迷宮體積為80 cm×50 cm×20 cm，水深9 cm，水溫(22±2)℃，內設多盲端曲折回路，終點處設置梯子供新生大鼠爬出水面進入可視平臺。第1次訓練前將新生大鼠放在梯子附近，使其自行爬上3次，以后每次訓練前，均使其自行爬上梯子1次。每只新生大鼠每天訓練1次，每次120 s，連續4 d。分別記錄每只新生大鼠從入水至到達平臺所需時間(逃避潛伏期)及進入盲端次數，以此作為新生大鼠的認知能力檢測指標。

1.3.3血液及海馬組織Pb、Cd水平測定

血液及海馬組織標本經濃硝酸消解后，采用PE700Z型原子吸收光譜儀測定Pb、Cd水平。

1.3.4海馬組織BDNF、ZnT7表達水平檢測

采用蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測海馬組織BDNF、ZnT7蛋白表達。首先提取新生大鼠海馬組織總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，置于-80 ℃保存備用。取50 μg蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，將分離的蛋白轉至PVDF膜轉膜，脫脂奶粉室溫封閉，分別加入一抗抗-BDNF(稀釋比1∶2 000)、抗-ZnT7(稀釋比1∶2 000)，抗-GAPDH抗體(稀釋比1∶10 000)，4 ℃孵育過夜，洗膜，添加二抗IgG(1∶5 000)室溫孵育1.5 h，洗膜，顯色，曝片，觀察并分析蛋白條帶灰度值。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 各組新生大鼠血液及海馬組織Pb、Cd水平比較

與NC組比較，Pb組、Pb+Cd組新生大鼠血液及海馬組織中Pb水平均顯著增加(P<0.05)，Cd組、Pb+Cd組新生大鼠血液及海馬組織中Cd水平均顯著增加(P<0.05)，見表1。

表1 各組新生大鼠血液及海馬組織Pb、Cd水平比較

2.2 各組新生大鼠認知能力比較

與NC組比較，Pb組、Cd組及Pb+Cd組新生大鼠逃避潛伏期及進入盲端次數顯著增加(P<0.05)，其中以Pb+Cd組最多(P<0.05)，見表2。

表2 各組新生大鼠認知能力比較

2.3 各組新生大鼠海馬BDNF、ZnT7水平比較

與NC組比較，Pb組、Cd組及Pb+Cd組新生大鼠海馬組織中BDNF水平顯著降低，其中以Pb+Cd組最低(P<0.05)，ZnT7水平顯著升高，其中以Pb+Cd組最高(P<0.05)。見表3、圖1。

表3 各組新生大鼠海馬BDNF、ZnT7蛋白相對表達水平比較

圖1 Western blot檢測新生大鼠海馬組織中BDNF、ZnT7蛋白表達

2.4 相關性分析

Pb+Cd組新生大鼠海馬組織中BDNF水平與血液及海馬Pb、Cd水平均呈負相關(P<0.05)，ZnT7水平與血液及海馬Pb、Cd水平均呈正相關(P<0.05)。見表4。

表4 Pb+Cd組新生大鼠海馬組織中BDNF、ZnT7水平與血液及海馬Pb、Cd水平的相關性

3 討 論

環境重金屬污染已成為嚴重影響人類健康的公共衛生事件之一，其中以Pb、Cd污染最為嚴重[8-9]。研究報道，我國育齡期婦女近20%血Pb超過100 μg/L，且母體血Pb極易通過胎盤轉運給胎兒，對胎兒造成各種傷害[10]。Cd主要存在于塵埃、土壤、水和食物中，亦可通過胎盤屏障進入胎兒體內，母體Cd是胎兒Cd暴露的唯一來源，其在體內的生物半衰期長達10～30年，在體內蓄積可嚴重影響小兒生長發育[11]。孕期是母子兩代生命銜接的非常時期，此時孕婦及胎兒對環境毒物更加敏感，所以與出生后暴露相比，各種毒性元素出生前暴露對生長發育的毒性作用更大。目前，單一重金屬損害健康已得到廣泛研究，但實際環境中，這些重金屬并非單獨存在。因此，為探究出生前Pb、Cd暴露對新生兒的毒害作用，本研究以妊娠SD大鼠為實驗模型，分別通過Pb、Cd單獨及聯合飲水染毒，評價其對新生大鼠神經功能的影響及可能機制。彭博等[12]研究報道，Pb暴露可導致小鼠學習記憶功能障礙及海馬蛋白激酶B表達降低。李宗光等[13]研究報道，低劑量汞、Pb、Cd聯合暴露可起協同神經毒性損傷作用，與海馬神經元凋亡、活性氧及鈣離子變化有關。本研究結果顯示，與NC組比較，Pb組、Pb+Cd組新生大鼠血液及海馬組織中Pb水平均顯著增加，Cd組、Pb+Cd組新生大鼠血液及海馬組織中Cd水平均顯著增加，提示妊娠期母鼠Pb、Cd暴露可能通過胎盤轉運至新生大鼠，臨床應建議女性孕前3個月進行血Pb、Cd檢查，以防止其含量過高影響胎兒發育。本研究還發現，與NC組比較，Pb組、Cd組及Pb+Cd組21 d齡新生大鼠逃避潛伏期及進入盲端次數顯著增加，其中以Pb+Cd組最多，提示妊娠期母鼠Pb、Cd暴露可能影響新生大鼠認知能力，且二者具有協同作用。

BDNF是神經營養因子家族成員，廣泛分布于中樞、周圍神經系統及內分泌系統等，可促進中樞神經元生長、分化、損傷修復、增強突觸信息傳遞、存儲及提高記憶、認知功能[14]。牛佳媛等[15]研究報道，缺血缺氧性腦損傷新生大鼠水迷宮實驗中逃避潛伏期延長，海馬組織BDNF水平顯著降低。孫向峰等[16]研究報道，缺氧缺血性腦損傷新生大鼠學習記憶能力及海馬BDNF水平顯著降低。大腦發揮正常功能亦需要一定水平的Zn2+維持穩定，但過量的Zn2+可對大腦產生毒性，造成神經元損傷，而Zn2+轉運需要以ZnT為載體[17]。粟立羽等[18]研究報道，錳中毒可破壞大鼠海馬區神經元細胞結構，增加海馬組織中Zn2+水平及ZnT3表達。ZnT7是一種定位在高爾基體復合體上的蛋白，可將Zn2+從細胞質中轉運至高爾基復合體內，參與各種調解細胞基因表達的DNA結合蛋白等含Zn2+蛋白的合成與加工[19]。池志宏等[20]研究報道，ZnT7在阿爾茲海默癥患者腦內高表達，沉默其表達可明顯抑制APP細胞轉基因β淀粉樣蛋白(Aβ)分泌，可作為AD治療的潛在靶點。FRAZZINI等[21]研究報道，Zn2+是神經元和大腦活動的多效性調節劑，腦Zn2+的藥理學失衡會損害BDNF相關信號通路和幼鼠的認知能力。本研究結果顯示，與NC組比較，Pb、Cd暴露可顯著降低新生大鼠海馬BDNF水平、提高ZnT7蛋白水平，均以Pb+Cd聯合作用最顯著，且Pb+Cd組新生大鼠海馬BDNF水平與血液、海馬Pb、Cd水平均呈負相關，Pb+Cd組新生大鼠海馬ZnT7水平與血液、海馬Pb、Cd水平均呈正相關，提示妊娠期Pb、Cd聯合暴露降低新生大鼠的認知能力可能與BDNF表達降低、ZnT7表達升高有關，推測其原因可能是Pb、Cd增加導致Zn2+代謝紊亂、Zn2+穩態平衡破壞，進而影響ZnT7及BDNF表達水平。

綜上所述，Pb、Cd聯合表現為協同毒性效應，妊娠期Pb、Cd暴露可顯著降低新生大鼠海馬BDNF表達，提高ZnT7蛋白表達，影響新生大鼠認知能力，可能為臨床預防和治療Pb、Cd毒性損傷提供一定理論依據。但本研究尚存在不足之處，其中關于Pb、Cd影響BDNF、ZnT7表達的具體作用通路機制尚不清楚，有待進一步深入探究。