綠茶多酚改善社會挫敗模型小鼠的抑郁行為研究*

劉志強，鄒永周，何 敏，楊 平，屈新輝△

(1.江西省人民醫院/南昌大學附屬人民醫院二部神經內科，南昌 330000;2.江西省景德鎮市第一人民醫院神經內科 333000)

抑郁癥是全球致殘性疾病之一。世界衛生組織(WHO)報告指出，2015年全球抑郁癥數量約占總人數的4.4%，其中女性患病率為5.1%，男性為3.6%，全球總患病人數為3.22億人[1]。抗抑郁性藥物及心理治療是目前臨床治療抑郁癥的主要手段，但目前診治的情況不容樂觀，有研究顯示其復發率高達80%[2]。有研究指出抑郁癥與執行功能障礙、工作記憶及反應速度等認知功能下降有關，而海馬是學習記憶的重要部位，但具體調節機制尚不明確。因此對抑郁癥藥物及其機制的研究成為焦點。

綠茶的主要成分綠茶多酚已被證實具有抗氧化作用，且有很高的安全性。有研究發現長期飲茶的人群抑郁癥的患病率低[3]，但具體機制尚不明確。國外[4]及國內[5]發現綠茶多酚對強迫游泳小鼠及懸尾試驗小鼠等抑郁模型具有抗抑郁作用，但對抗抑郁的具體機制研究不夠深入。社會挫敗模型是一種模擬社會和心理因素產生抑郁癥的一種模型，被廣泛應用。本實驗以社會挫敗模型研究綠茶多酚對其抑郁作用的影響及相關機制，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器設備、藥品和試劑

3月齡CD1小鼠、2月齡C57BL/6小鼠購于北京維通利華公司，綠茶多酚(C0567)、磷酸化環腺苷效應元件結合蛋白(cAMP response element-binding protein，p-CREB)抗體(06-519)、腦源性神經生長因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)抗體、K252a購于美國Sigma公司。Western blot顯影系統、強迫游泳行為學系統、水迷宮行為學系統。

1.2 方法

1.2.1社會挫敗模型的建立

篩選攻擊能力強的CD1小鼠，將C57BL/6小黑鼠放入CD1的籠子中，每天接觸10 min，其他時間用帶小孔的透明隔板將兩小鼠分開。每天將C57BL/6小鼠暴露給不同的CD1小鼠，10 d之后進行社會交互實驗的檢測。進一步使用強迫游泳行為學系統、水迷宮行為學系統評估小鼠抑郁模型，對不符合要求的小鼠予以剔除。

1.2.2強迫游泳

將小鼠放在一個高20 cm、直徑15 cm、水深10 cm、水溫為(23±2)℃的盛水容器中，給小鼠制造一個無法逃離的環境，一段時間后，小鼠即表現出不動狀態。先進行適應訓練2 d，第3天記錄后4 min中內總共靜止的時間。

1.2.3水迷宮

將小鼠頭面向池壁放在水中，記錄小鼠找到平臺所用時間(s)。在訓練時，如果這個時間超過60 s，則引導小鼠到平臺。讓小鼠在平臺上待10 s。每只動物每天訓練4次，訓練間隔15～20 min，連續訓練5 d。上述訓練結束后的第2天將平臺撤除，進行探查訓練，共60 s。探查訓練后的第2天，進行對位訓練，共4 d。將平臺放回原平臺所在的對側象限，每天訓練4次，統計達到平臺所用的時間。

1.2.4對抑郁模型鼠腹腔注射不同濃度的綠茶多酚

取模型鼠24只分為3組，每組8只，分別為低劑量綠茶多酚(5 mg/kg)處理組，高劑量綠茶多酚(20 mg/kg)處理組及生理鹽水處理組；另選取為正常C57BL/6鼠給予生理鹽水處理，為空白對照組。對上述小鼠連續1周給予上述藥物或生理鹽水處理，每天給藥時間固定，飼養條件相同。1周后先進行適應訓練，后進行強迫游泳、水迷宮等行為學檢測。

1.2.5海馬組織微量注射BDNF阻斷劑K252a

取模型鼠24只分為3組，每組8只，分別為高劑量綠茶多酚(20 mg/kg)處理組、K252a+高劑量綠茶多酚(20 mg/kg)處理組及生理鹽水處理組；C57BL/6小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，固定在立體定向架上。切開頭皮，在左右海馬頭骨上打孔。坐標為：前囟門后1.7 mm，中線附近±1.8 mm，硬腦膜下深度2.0 mm。植入套管，縫合皮膚。術后腹腔注射青霉素3 d。在綠茶多酚處理前，雙側海馬微量注射K252a，每側體積0.5 μL，注射速率0.2 μL/min，海馬微量注射K252a劑量為10 μg/μL，其余各組注射等量生理鹽水溶液。隨后高劑量綠茶多酚處理組、K252a+高劑量綠茶多酚處理組注射綠茶多酚20 mg/kg,生理鹽水處理組注射等量生理鹽水。手術后，小鼠能自主活動后被關在籠子里。

1.2.6Western blot技術測定CREB、p-CREB及BDNF表達

取空白對照組、模型組、低劑量綠茶多酚組、高劑量綠茶多酚組C57BL/6小鼠各8只，斷頭處死小鼠，迅速取腦剝離獲取雙側海馬組織，用離心管分裝，加入適量的蛋白裂解液，用勻漿器充分研磨組織，放置于冰上裂解30 min，將組織放于高速離心機離心15 min(12 000 r/min，4 ℃)，吸取上清液，用BCA法定量蛋白濃度。將樣本與上樣緩沖液按體積3∶1加入4 ×上樣緩沖液，混勻，在100 ℃水中煮沸5 min，分裝后置于-20 ℃冰箱凍存備用。用BCA法進行蛋白定量，各泳道加入30 μg蛋白，先用恒流后用恒壓進行蛋白的電泳分離，轉膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，轉膜時間為1 h。用10%的脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗p-CREB抗體(1∶2 000)、CREB抗體(1∶2 000)、BDNF抗體(1∶500)4 ℃孵育過夜，用TBST沖洗3次，加入二抗(1∶3 000)室溫孵育1 h，TBST沖洗3次后加入ECL液顯色。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 綠茶多酚可以改善模型小鼠強迫游泳不動時間且與濃度相關

與空白組[(60.3±3.9)s]小鼠比較，模型組[(113.8±10.3)s]小鼠的強迫游泳不動時間明顯延長(P<0.05,n=8)；與模型組小鼠比較，低劑量綠茶多酚處理組[(96.7±9.2)s]和高劑量綠茶多酚處理組[(82.8±8.3)s]小鼠強迫游泳不動時間都下降，且綠茶多酚高劑量處理組下降得更明顯(P<0.05，n=8)，見圖1A。與模型組[(118.6±12.2)s]小鼠比較，高劑量綠茶多酚處理組[(80.6±8.1)s]小鼠強迫游泳不動時間下降(P<0.05，n=8)，而K252a能夠逆轉高劑量綠茶多酚的作用，K252a+高劑量綠茶多酚處理組[(118.6±12.2)s]小鼠強迫游泳不動時間與模型組[(113.5±8.7)s]比較,差異無統計學意義(P>0.05，n=8)。見圖1B。

A:各組小鼠強迫游泳不動時間;B:海馬微量注射K252a后各組小鼠強迫游泳不動時間。a:P<0.05,與空白組比較；b:P<0.05,與模型組比較。

2.2 綠茶多酚可以減少模型小鼠水迷宮潛伏期時間，且與濃度相關。

社會模型組[(46.4±4.3)s]小鼠的水迷宮潛伏期時間明顯長于空白組[(20.5±2.4)s]小鼠(P<0.05,n=8)；單因素方差分析發現，與模型組比較,低劑量[(38.2±3.6)s]和高劑量綠茶多酚處理組[(30.2±3.1)s]小鼠水迷宮潛伏期時間都下降，且高劑量綠茶多酚處理組潛伏期時間下降更明顯(P<0.05，n=8)，見圖2A。與模型組[(48.9±4.3)s]比較，高劑量綠茶多酚處理組[(33.6±3.4)s]小鼠水迷宮潛伏期時間下降(P<0.05，n=8)，而K252a能夠逆轉高劑量綠茶多酚的作用，水迷宮潛伏期時間與模型組比較，K252a+高劑量綠茶多酚處理組[(45.3±4.1)s]差異無統計學意義(P>0.05，n=8)，見圖2B。

A:各組小鼠水迷宮潛伏期時間；B：海馬微量注射K252a后各組小鼠水迷宮潛伏期時間。a:P<0.05,與空白組比較；b:P<0.05,與模型組比較。

2.3 小鼠海馬區CREB-BNDF通路參與綠茶多酚抗抑郁作用的調節。

與空白組比較，模型組小鼠海馬區蛋白p-CREB相對表達水平、BDNF相對表達水平都下降(P<0.05,n=8)。而與模型組比較，低劑量和高劑量綠茶多酚處理組海馬區p-CREB相對表達水平、BDNF相對表達水平表達升高，且高劑量組逆轉更明顯(P<0.05,n=8)，見圖3。

A、B：Western blot圖；C、D：Western blot分析圖。a：P<0.05，與空白組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.01，與模型組比較。

3 討 論

抑郁癥也稱為單相抑郁，是全球致殘性疾病之一。美國資料顯示，抑郁癥人群中的年自殺率為83.3/10萬，中國的年自殺率已達22.2/10萬[6]。抗抑郁性藥物及心理治療是目前臨床治療抑郁癥的主要手段，但目前診治的情況不容樂觀，有研究估計大約1/3的患者經治療4個月后癥狀緩解[7]。治療抑郁癥的進展一直很緩慢，部分原因是制藥行業退出了新型精神藥物的開發，因此探索新的抑郁癥藥物及其機制意義重大。

綠茶多酚已被證實具有抗氧化作用，它經口服吸收后分布廣泛，能夠透過血腦屏障到達腦組織起著重要的神經保護作用，且安全性很高。有研究發現長期飲茶的人群抑郁癥的患病率低。74名健康受試者參與了1個雙盲隨機安慰劑對照研究，連續5周口服綠茶或安慰劑,之后進行測量。結果表明，與安慰劑比較，飲用綠茶的參與者抑郁得分有所下降[8]。目前認為抑郁癥的病因主要是精神應激、遺傳因素和反復的軀體疾病，而精神應激為主要病因[9]。人類的應激因素無處不在，這些應激源可導致挫敗感、情緒低落和興趣缺失等抑郁癥狀產生。社會挫敗模型是一種模擬社會和心理因素產生抑郁癥的一種模型，被廣泛應用。其中社會挫敗應激模型，可以更好地模擬人類對于應激的反應。通過將小鼠暴露在10 d的社會挫敗應激中，用以誘導小鼠的抑郁表現，形成社會挫敗模型。本研究發現社會挫敗模型小鼠的強迫游泳不動時間明顯長于正常小鼠，說明社會挫敗應激可以成功建立抑郁模型；而腹腔注射綠茶多酚1周能夠使小鼠強迫游泳不動時間下降，且高劑量綠茶多酚處理組小鼠下降得更明顯。

有研究指出抑郁癥與執行功能障礙、工作記憶及反應速度等認知功能下降有關。有研究表明約40%的抑郁癥患者存在至少一種認知領域的損傷[10]。同時，1項meta研究結果指出抑郁癥治愈后執行功能的損傷可以恢復，表明執行功能的損傷與抑郁同時發生，而不是抑郁癥的特征[11]。研究發現抑郁癥患者與健康對照組比較，海馬體積下降是最可靠的神經影像結構發現之一，多項meta分析結果表明4%～10%患者出現雙側海馬體積下降超過40年，抑郁病史或者嚴重的抑郁患者海馬體積減少的可能性更大，而使用抗抑郁藥物3年后左側海馬體積增加，這也間接支持抑郁與海馬體積之間的關系[12]。本研究結果也發現社會挫敗模型小鼠的水迷宮潛伏期時間延長，說明抑郁小鼠認知功能下降。而腹腔注射綠茶多酚1周能夠使小鼠水迷宮潛伏期時間下降，且綠茶多酚高劑量組下降得更明顯，說明綠茶多酚改善抑郁的作用可能與改善認知功能有關。

很多研究顯示，轉錄因子CREB與抑郁癥的發病機制及抗抑郁藥的效用相關。雒明池等[13]研究表明慢性溫和不可預知性應激刺激致抑郁行為改變的小鼠較對照組出現海馬內CREB表達水平下降[14]。而長期使用抗抑郁藥物可提高海馬CREB活性及海馬區齒狀回神經細胞的增殖和分化功能。有研究使海馬CREB過度表達，隨后激活一些神經生長因子營養因子(如BDNF)能夠促進海馬區新生神經細胞增殖、成熟及分化。因此認為CREB活性增高可能是抗抑郁作用的機制之一[13]。本研究也發現，模型鼠海馬區蛋白p-CREB、BDNF表達都下降(P<0.05)，而綠茶多酚處理組可以逆轉海馬區p-CREB、BDNF表達，且高劑量組逆轉更明顯，表明綠茶多酚通過海馬區CREB-BDNF通路參與調節社會挫敗模型小鼠的抑郁行為。進一步研究也發現，通過雙側海馬區微量注射BDNF阻斷劑K252a阻斷BDNF效應，強迫游泳和水迷宮的行為學試驗都證實綠茶多酚改善抑郁行為的效應被K252a逆轉。

因此，本研究發現綠茶多酚可以通過海馬區CREB-BDNF通路改善社會挫敗模型小鼠的抑郁行為。為綠茶多酚的抗抑郁應用提供更多理論依據。