慢性心力衰竭患者血清miR-30a、miR-101a表達及其與心肌重構和心功能的相關性*

高 敏，吳 藝，高守君，郝麗琴

(1.四川省雅安市人民醫院急診科 625000；2.四川省雅安市第四人民醫院老年科 625000)

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是一種臨床常見疾病，是各種心臟疾病的終末階段[1]。據報道顯示，全球CHF發病率為1.5%～2.0%，病死率為5.6%～15.4%，近年隨著我國人口老齡化加速，CHF發病率呈逐年增加趨勢，嚴重影響患者生命健康，給社會及患者家庭帶來沉重負擔[2]。目前CHF發病機制尚不完全清楚，臨床多采用對癥治療，這對患者預后改善效果不佳。有研究報道，神經內分泌過度激活和心肌重構是CHF發生的重要機制，早期發現并逆轉心肌重構是CHF療效的關鍵[3-4]。微RNA(microRNA，miRNA)是一種高度保守的單鏈非編碼小RNA，參與機體和細胞的多種生物學功能，且其表達具有組織和細胞特異性。越來越多研究表明，miRNA在心力衰竭、心肌梗死、心律失常等心血管疾病發生發展過程中發揮重要作用[5-8]。研究報道，血清miR-30a水平與先天性心臟病心功能變化有關，miR-101a下調與房顫電重構機制有關[9-10]，miR-101a和miR-30b有助于減輕β-細胞炎癥因子引起的機體功能障礙[11]，但關于血清miR-30a、miR-101a與CHF的關系鮮有文獻報道。因此，本研究通過觀察血清miR-30a、miR-101a表達水平變化，探究其與CHF患者心肌重構及心功能的關系，以期為臨床CHF患者治療提供一定理論指導。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年3月至2019年6月四川省雅安市人民醫院收治的住院治療的CHF患者128例為CHF組，其中男74例，女54例，年齡39～76歲，平均(68.19±8.28)歲。CHF診斷參照《中國心力衰竭診斷和治療指南(2014)》[12]：(1)有心臟病史、癥狀及體征；(2)水腫、乏力、呼吸困難等癥狀持續時間超過半年；(3)左室射血分數(left ventricular ejection fraction，LEVF)保留；(4)運動耐力明顯下降。納入標準：(1)符合CHF診斷標準；(2)年齡35～80歲；(3)男性左室舒張末期內徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD)>55 mm，女性LVEDD>50 mm；(4)臨床檢查資料完整且自愿配合調查研究。排除標準：(1)入院前1個月接受經皮冠狀動脈介入術治療者；(2)有急性心肌梗死、不穩定性心絞痛、急性心肌炎等其他心臟疾病者；(3)合并肝、腎、甲狀腺等重要臟器功能障礙者；(4)合并心臟瓣膜性、慢性阻塞性肺疾病及肺動脈栓塞者。進一步參照紐約心臟病協會(New York Heart Association，NYHA)心功能分級標準及6 min步行試驗結果，由兩名內科主治醫師評定分為：日常活動無或有輕微癥狀，休息時癥狀無且6 min步行距離大于450 m的患者為NYHA心功能分級Ⅰ+Ⅱ級，共41例；日常活動明顯受限，休息時無癥狀且6 min步行距離150～450 m的患者為NYHA心功能分級Ⅲ級，共50例；活動嚴重受限，休息狀態下可出現心力衰竭(HF)癥狀且6 min步行距離小于150 m的患者為NYHA心功能分級Ⅳ級，共37例。另取同期門診體檢健康者50例為對照組，其中男28例，女22例，年齡39～79歲，平均(67.23±8.16)歲。CHF各分級患者與對照組年齡、性別比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經過四川省雅安市人民醫院倫理委員會批準通過，收集受試者所有臨床檢查資料，所有樣品采集及資料調查均取得患者及其家屬知情同意并簽字確認，符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》。

1.2 試劑及主要儀器

TRIzol試劑(貨號R0016，購自上海碧云天生物技術有限公司)，實時熒光定量PCR(RT-PCR)試劑盒(貨號638316)、PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real Time，貨號RR037A)購自日本TaKaRa公司，引物由上海吉瑪生物科技有限公司合成；紫外分光光度計購自美國Thermo Fisher公司、RT-PCR儀7500型購自美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1血清miR-30a、miR-101a mRNA水平檢測

采集患者入院第2天清晨空腹肘靜脈外周血4 mL，3 500 r/min離心10 min，分離血清置于-80 ℃冰箱待檢。采用TRIzol提取血清總RNA，用紫外分光光度計檢測總 RNA 濃度及純度，當260 nm與280 nm處理吸光度值比值(A260/A280)為1.8～2.0時為樣品合格。逆轉錄獲得模板cDNA，置于-20 ℃保存備用。RT-PCR檢測miR-30a、miR-101a mRNA相對表達水平，采用20 μL反應體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×) 10.0 μL，ROX Ⅱ(50×) 0.4 μL，cDNA(50 ng/ μL) 2.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，ddH2O 6.0 μL。反應條件設置為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s，40個循環；添加溶解曲線。miR-30a上游引物序列5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG-3′，下游引物序列5′-CAC AGC TCG TAG AAC AGG AGG-3；miR-101a上游引物序列5′-TAC AGT ACT GTG AUA ACT GAA-3′，下游引物序列5′-CAG TTA TCA GTA CTG TAT T-3′；內參U6上游引物序列5′-GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T-3′，下游引物序列5′-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT-3′。采用2-ΔΔCt法對血清miR-30a、miR-101a mRNA相對水平進行定量分析。

1.3.2超聲心動圖檢查

由同一名指定超聲醫師采用Philips IE33超聲儀，參照美國超聲心動圖學會推薦的方法檢測心肌重構及心功能相關指標[13]，主要包括心輸出量(cardiac output，CO)、LVEF、左室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness,LVPW)、LVEDD、左房內徑(left atrial diameter，LAD)、左室質量指數(left ventricular mass index，LVMI)、左室重構指數(left ventricular reconsitution index，LVRI)。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 CHF患者與對照組血清miR-30a、miR-101a mRNA相對表達水平比較

與對照組比較，CHF組各分級患者miR-30a、miR-101a mRNA水平均升高，miR-101a mRNA水平均降低，且隨心功能分級增加血清miR-30a mRNA水平逐級升高，miR-101a mRNA水平逐級降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 CHF患者與對照組血清miR-30a、miR-101a mRNA水平比較

2.2 CHF患者與對照組心肌重構和心功能指標比較

與對照組比較，CHF組患者CO、LVEF、LVRI均降低，且隨心功能分級增加而逐級降低，LVPW、LVEDD、LAD、LVMI均升高，且隨心功能分級增加而逐級升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 CHF組患者與對照組心肌重構和心功能指標比較

2.3 CHF患者血清miR-30a、miR-101a mRNA水平相關性分析

CHF組患者血清miR-30a水平與miR-101a水平呈負相關(r=-0.864，P<0.05)，見圖1。

圖1 CHF患者血清miR-30a、miR-101a mRN水平相關性分析

2.4 CHF患者血清miR-30a、miR-101a mRNA水平與心肌重構和心功能指標的相關性分析

CHF組患者血清miR-30a mRNA水平與CO、LVEF、LVRI呈負相關，與LVPW、LAD、LVMI呈正相關(均P<0.05)；CHF患者血清miR-101a mRNA水平與CO、LVEF、LVRI呈正相關，與LVPW、LAD、LVMI呈負相關(均P<0.05)，血清miR-30a、miR-101a mRNA水平與LVEDD無相關性(P>0.05)。見表3。

表3 CHF患者血清miR-30a、miR-101a mRNA相對表達水平與心肌重構和心功能指標的相關性

3 討 論

CHF作為各種心臟疾病的終末期，臨床表現極為復雜，其中多表現為心臟收縮或(和)舒張功能障礙，患者心功能逐漸惡化，左心室排血障礙，引起神經、內分泌等多系統代償性變化，心肌細胞外心包信號異常、膠原異常沉積、炎癥細胞浸潤等，最終引起心肌重構，心肌重構是機體對損傷的一種適應性反應，其嚴重程度與心功能分級密切相關[2,14]。CO、LVEF、左室收縮末期直徑(LVESD)、左室收縮末期容積(LVESV)等可反映CHF患者左心室收縮功能，LVEDD、LVPW可反映左心室、左心房壁厚度，LAD、LVMI、LVRI可反映患者心肌重構整體情況[2-3]。丁玫等[15]研究發現，與健康對照組比較，CHF患者LVPW、LAD、LVEDD顯著升高。龔進坤等[16]研究報道，CHF患者LVESD、LVD、RVD均高于健康對照組，且與CHF失代償組比較，CHF代償組患者LVEF升高，LVESD、LVESV降低。本研究結果發現，與對照組比較，CHF組患者CO、LVEF、LVRI均降低，且隨心功能分級增加而逐級降低，LVPW、LVEDD、LAD、LVMI均升高，且隨心功能分級增加而逐級升高，提示CO、LVEF、LVPW、LVEDD、LAD、LVMI、LVRI可作為反映心功能及心肌重構的指標。

miRNA是一類長度18～25個核苷酸的內源性單鏈非編碼RNA，在機體各組織中廣泛表達，通過與mRNA 3′端非編碼區靶向結合調節基因轉錄后的表達。徐振宇等[2]研究報道，血清miR-133a、miR-133b水平隨CHF患者心功能分級增加而升高，與CHF患者心肌重構及心功能有關。劉雪貞等[9]研究報道，先天性心臟病合并CHF患兒血清miR-30a水平顯著高于單純先天性心臟病患兒及健康對照組兒童。李艷茹等[10]研究報道，與健康對照組比較，房顫組乳鼠心房細胞miR-101a、miR-101b水平顯著下調，與房顫電重構機制有關。ROUX等[11]研究報道，miR-30a、miR-101a水平在炎癥因子介導的Ⅰ型糖尿病胰島β-細胞功能失調過程中起重要作用，白細胞介素(IL)-1β可增加MIN6細胞中miR-30a、miR-101a水平，二者水平與胰島-β細胞凋亡有關。本研究結果發現，與對照組比較，CHF患者血清miR-30a mRNA水平升高，且隨CHF患者心功能分級增加逐級升高，血清miR-101a mRNA水平降低，且隨心功能分級增加逐級降低，提示血清miR-30a mRNA水平上調，miR-101a mRNA水平下調可能與CHF發生有關。本研究還發現，CHF患者血清miR-30a mRNA水平與miR-101a mRNA水平呈負相關，miR-30a mRNA水平與CO、LVEF、LVRI呈負相關，與LVPW、LAD、LVMI呈正相關；miR-101a mRNA水平與CO、LVEF、LVRI呈正相關，與LVPW、LAD、LVMI呈負相關，提示miR-30a、miR-101a可能與CHF患者心肌重構和心功能有關，監測血清miR-30a、miR-101a mRNA水平可能對CHF患者病情嚴重程度及預后評估有一定指導意義。

綜上所述，血清miR-30a、miR-101a mRNA水平隨CHF患者心功能分級增加分別升高和降低，與心肌重構和心功能密切相關，可能對CHF患者病情嚴重程度及預后評估有一定指導意義。但由于本研究樣本量小且關于miR-30a、miR-101a在CHF心肌重構過程的具體調控機制仍未知，后期仍需加大樣本量進一步深入探討。