黏附連接蛋白Afadin在結(jié)直腸癌組織中的表達及臨床意義*

桂 林,卞紅磊,于溯洋,程敏靜,梁春慧

(河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院：1.肛腸一科；2.藥劑科，石家莊 050051)

Afadin是近期發(fā)現(xiàn)的一種黏附連接蛋白，在細胞內(nèi)與連接素(Nectins)、上皮細胞鈣黏蛋白 (E-cadherin)及纖維狀肌動蛋白(F-actin)等構(gòu)成黏附連接，參與調(diào)控細胞定向移動、增殖等多種功能[1-3]。與此同時，多種腫瘤中存在Afadin編碼基因的異常融合，在某些類型的腫瘤，例如乳腺癌[4]、子宮內(nèi)膜癌[5]及胰腺癌[6]中，還存在Afadin表達水平的改變，本研究將檢測Afadin在結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)中的表達情況，結(jié)合臨床資料分析其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究已經(jīng)通過本院臨床研究倫理學會委員會批準(批準號：H2016-008-1)。所有患者均在本院肛腸一科手術(shù)，術(shù)前都未接受新輔助治療。第一組病例包含2017年1-12月20例CRC患者，分別留取腫瘤組織及相對應的非腫瘤組織，進行蛋白免疫印記(Western blot)和免疫組織化學染色檢測；第二組病例包含2010年1月至2013年1月共118例CRC患者，每例患者均擁有較為完整的病例資料和隨訪信息，腫瘤組織切片進行免疫組織化學染色評分，并與臨床病理資料和預后資料進行相關(guān)性分析。

1.2 方法

1.2.1主要試劑

兔抗人Afadin多克隆抗體購于美國Abcam公司，SP試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒及電化學發(fā)光(ECL)試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.2.2Western blot

提取總蛋白，采取BCA法進行蛋白定量，每組上樣20 μg，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，轉(zhuǎn)膜，一抗孵育過夜，二抗孵育1.5 h，ECL顯影，以GAPDH為內(nèi)參計算Afadin的表達水平。

1.2.3免疫組織化學染色及結(jié)果判定

切片脫蠟入水，熱修復法進行抗原修復，滴加一抗后4 ℃孵育12 h，此后依次滴加二抗和辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素，DAB顯色，復染后脫水透明封片。由兩位病理科醫(yī)師單獨進行結(jié)果評分。密度評分分為：0分(陰性，無黃色)，1分(弱陽性，呈淺黃色)，2分(中等陽性，呈棕黃色)，3分(強陽性，呈棕色)，陽性細胞比例評分分為：0分(未見陽性細胞)，1分(陽性細胞百分比小于25%)，2分(陽性細胞百分比25%～50%)，3分(陽性細胞百分比大于50%)，兩個評分相乘即獲得免疫組織化學染色評分。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 Afadin在CRC組織中的表達

利用Western blot對20例CRC患者的腫瘤組織及相對應非腫瘤組織進行Afadin表達水平檢測，其中的15對標本(75%)，腫瘤組織中的Afadin表達水平低于相對應的非腫瘤組織(P<0.05)，見圖 1。對標本進行了免疫組織化學染色，結(jié)果顯示，Afadin陽性細胞呈現(xiàn)細胞膜和細胞質(zhì)著色。在非腫瘤組織中，Afadin呈中或強陽性表達(免疫組織化學染色評分大于4分)的比例為70.0%(14/20)，而在腫瘤組織中，Afadin呈中或強陽性表達的比例為30.0%(6/20)，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖2。

A:Western blot檢測結(jié)果;B:兩組標本表達平均灰度值比較;T:腫瘤組織；N：非腫瘤組織；1、2、3、4為病例號。

A:Afadin在腫瘤組織中低表達(×200)；B：Afadin在非腫瘤組織中高表達(×200)；C:兩組間免疫組織化學染色評分比較。

2.2 CRC組織中Afadin表達水平與臨床病理學因素之間的相關(guān)性分析

為了進一步分析CRC組織中Afadin表達水平與臨床病理因素之間的相關(guān)性，筆者利用免疫組織化學染色的方法對118例CRC患者的腫瘤組織切片進行Afadin表達水平檢測，根據(jù)免疫組織化學染色評分將其分為兩組，Afadin高表達組(IHC評分大于4分)及Afadin低表達組(IHC 評分小于或等于4分)，然后與患者的臨床病理資料進行相關(guān)性研究，單因素分析結(jié)果顯示，腫瘤組織中的Afadin表達水平與患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、病理組織學類型、脈管浸潤、神經(jīng)浸潤均無明顯相關(guān)性(P>0.05)，但是在浸潤深度達到T3水平及以上(P=0.020)或出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.043)的腫瘤組織中，Afadin低表達的發(fā)生率明顯升高，見表1。

表1 118例CRC患者組織標本Afadin表達水平和臨床病理因素之間的關(guān)系

2.3 CRC組織中Afadin表達水平對預后的影響

在上述118例CRC患者中，筆者還進行了Afadin表達水平與預后的相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，腫瘤組織中Afadin低表達患者總的生存率更低(P<0.01)，見圖3。將年齡、性別及Afadin表達水平引入Cox多因素回歸分析，結(jié)果顯示，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Afadin低表達是CRC預后的獨立風險因素，見表2。

圖3 Afadin高表達組和低表達組CRC患者的生存曲線

表2 118例CRC患者預后的Cox多因素回歸分析

3 討 論

細胞極性的建立對于維持上皮細胞的屏障功能是至關(guān)重要的，細胞極性喪失不僅會導致上皮出現(xiàn)滲漏，還在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用，參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及腫瘤轉(zhuǎn)移的過程，目前，細胞極性喪失已經(jīng)被看作是進展期上皮性腫瘤的標志之一[7-8]。細胞極性的建立是一個多步驟過程，其中之一就是細胞黏附和連接復合體的正確組合，細胞與細胞之間的黏附主要依靠黏附連接(AJs)及緊密連接(TJs)維持。構(gòu)成黏附連接的幾種成分，例如E-cadherin 和 Catenins，與腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系，目前已經(jīng)成為腫瘤研究領(lǐng)域的關(guān)注熱點[9]。Afadin作為黏附連接蛋白之一，幾乎存在于所有的上皮細胞之中，它捆綁肌動蛋白微絲和Nectins構(gòu)成肌動蛋白骨架，參與調(diào)控多種細胞功能。鑒于Afadin在維持細胞極性中的關(guān)鍵性作用，它也逐漸受到腫瘤研究領(lǐng)域的關(guān)注，逐漸增多的研究結(jié)果顯示，在多種類型的腫瘤中，存在Afadin表達水平的改變，并與腫瘤的惡性表現(xiàn)密切相關(guān)，例如Afadin與Claudin-2協(xié)作，共同促進乳腺癌細胞出現(xiàn)轉(zhuǎn)移[10]；在三陰乳腺癌對阿霉素耐藥的產(chǎn)生機制中，也有Afadin的參與[11]；對于惡性膠質(zhì)瘤來說，Afadin促進了病理性血管形成[12]；當胃癌細胞感染幽門螺桿菌后，Afadin的表達水平下降，同時伴有上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[13]；緊密連接蛋白2通過下調(diào)Afadin/ERK信號通路，抑制骨肉瘤細胞轉(zhuǎn)移[14]，這些研究都提示，Afadin可能通過多個途徑，廣泛參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。

根據(jù)上述研究結(jié)果，筆者推測，在CRC中可能也存在Afadin表達水平的改變，為了驗證這種推測，本研究首先選擇了20例CRC患者的腫瘤組織及其對應的非腫瘤組織，分別利用Western blot及免疫組織化學染色的方法對Afadin蛋白表達水平進行了檢測，兩種檢測的結(jié)果都顯示，與對應的非腫瘤組織比較，CRC組織中確實存在Afadin表達水平下降的現(xiàn)象。隨后，為了檢驗Afadin的表達水平是否能夠反映腫瘤的惡性程度，本研究又選擇了擁有完整病例資料和隨訪信息的118例CRC患者，分別對腫瘤組織切片進行免疫組織化學染色評分并與臨床病理因素和預后資料進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，腫瘤組織中 Afadin的表達水平與腫瘤的浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況密切相關(guān)，與Afadin高表達的患者比較，Afadin低表達的患者總生存率明顯降低，Afadin低表達是CRC預后的獨立風險因素，這些結(jié)果提示，Afadin參與CRC的發(fā)展與轉(zhuǎn)移，CRC出現(xiàn)Afadin表達水平降低，預后不良。

盡管本研究發(fā)現(xiàn)，在CRC中存在Afadin表達水平的改變，但是這種改變是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄、翻譯還是翻譯后加工及修飾層面并不明確，筆者將繼續(xù)進行相關(guān)研究；與此同時，筆者還將對CRC細胞的Afadin表達水平進行干預，觀察干預后CRC細胞生物學特性的改變，以進一步明確Afadin與CRC的相關(guān)性，為探索Afadin是否能夠成為治療CRC的新靶點提供依據(jù)。