miR-125b和miR-335在炎癥性腸病患者外周血和腸黏膜中的表達研究*

楊文宏,孫惠芳,楊 潔

(河北省秦皇島市第一醫院：1.內科ICU；2.重癥醫學一科；3.消化內一科 066000)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種慢性病，主要發生于機體的胃腸等消化道部位，臨床病理類型主要包括潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn′s disease，CD)。最近數據資料顯示，IBD的發病率在我國呈上升趨勢[1-3]，給我國人民健康造成嚴重威脅。目前有關該疾病的病因和發病機制仍不清楚。微RNA(microRNA,miRNA)是由20個左右堿基構成的微小RNA分子，可與mRNA 3′端非編碼區(3′UTR)結合，調節基因表達，參與個體發育、細胞增殖、細胞凋亡和細胞分化等生命活動過程[4-5]。已有研究表明miR-125b與miR-335可通過介導多條代謝通路影響UC和CD的發生發展[6]，但具體作用機制尚不清楚。本研究通過對IBD患者(CD患者及UC患者)外周血血清及其腸黏膜組織中miR-125b與miR-335的表達水平進行檢測，分析二者與疾病活動度、病變嚴重程度的相關性，以期為臨床研究腸道相關慢性炎癥疾病提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年5月至2019年6月在本院消化內科經診斷確診的IBD患者117例，其中CD患者62例，男35例，女27例，平均年齡(39.19±6.75)歲；UC患者55例，男34例，女21例，平均年齡(42.91±8.13)歲。納入標準：(1)年齡20～70歲；(2)符合2012年《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見》中關于UC、CD的診斷標準[7]；(3)各項檢查資料完整；(4)患者及患者家屬均簽署知情同意書。排除標準：(1)過去3個月內使用過水楊酸制劑、糖皮質激素、免疫抑制劑及生物制劑等；(2)合并心血管疾病和肝腎疾病；(3)合并惡性腫瘤；(4)合并其他自身免疫性疾病；(5)哺乳及妊娠期婦女。同期招募健康志愿者51例(對照組)，男32例，女19例，平均年齡(40.26±6.98)歲。在腸鏡下取患者黏膜2塊與對照者的小腸黏膜2塊置于液氮中保存備用；分別采集IBD患者與健康對照者空腹靜脈血4 mL，分離血清置于冰箱備用。本研究通過本院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑與儀器

RNA提取試劑盒購自北京天根生化有限公司；AceQ qPCR SYBR?Green Mix購自南京Vazyme生物公司；實時熒光定量PCR(RT-PCR)儀購自美國Bio-Rad公司；本研究引物由西安擎科生物公司合成。

1.3 方法

1.3.1RT-PCR檢測miR-125b、miR-335 mRNA相對表達水平

從液氮取出腸黏膜組織及血清，采用RNA提取試劑盒(天根)提取組織及血清中的總RNA，經反轉錄得cDNA。采用RT-PCR儀對miR-125b和miR-335進行PCR擴增。RT-PCR反應體系共10 μL：miScript SYBR?Green Mix 5.0 μL，cDNA(50 ng/μL)1.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，ddH2O 3.0 μL。反應條件：95 ℃ 90 s；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，40個循環。miR-125b和miR-335及內參U6的引物序列見表1。采用2-ΔΔCT法對miR-125b、miR-335 mRNA相對表達水平進行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.2IBD患者的活動度、病變嚴重程度比較

根據改良Mayo評分標準[8]評估UC患者活動度，其中輕度活動20例(UC輕度活動組)、中度活動23例(UC中度活動組)、重度活動12例(UC重度活動組)；根據CD活動指數 (CDAI)[9]評估CD患者活動度，其中輕度活動18例(CD輕度活動組)、中度活動25例(CD中度活動組)、重度活動19例(CD重度活動組)。采用修正Baron評分系統[8]、CD 內鏡嚴重程度指數(CDEIS)分別評估UC、CD患者內鏡下病變嚴重程度。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 CD患者外周血血清及腸黏膜組織中miR-125b、miR-335 mRNA相對表達水平比較

與對照組比較，CD輕度活動組、CD中度活動組、CD重度活動組患者外周血血清及腸黏膜組織中miR-125b、miR-335 mRNA相對表達水平依次降低(P<0.05)，見表2。

表2 miR-125b、miR-335 mRNA在CD患者外周血血清及腸黏膜組織中的表達

2.2 UC患者外周血血清及腸黏膜組織中miR-125b、miR-335 mRNA相對表達水平比較

與對照組比較，UC輕度活動組、UC中度活動組、UC重度活動組患者外周血血清及腸黏膜組織中miR-125b、miR-335 mRNA相對表達水平依次降低(P<0.05)，見表3。

表3 miR-125b、miR-335 mRNA在UC患者外周血血清及腸黏膜組織中的表達

2.3 CD患者活動度、病變嚴重程度比較

CD輕度活動組、CD中度活動組、CD重度活動組患者的CDAI、CDEI均依次升高(P<0.05)，進一步兩兩比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 CD患者的CDAI、CDEI比較

2.4 UC患者活動度、病變嚴重程度比較

UC輕度活動組、UC中度活動組、UC重度活動組患者的改良Mayo評分、修正Baron評分均依次升高(P<0.05)，進一步兩兩比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見表5。

表5 UC患者的改良Mayo評分和修正Baron評分的比較分)

2.5 CD患者血清miR-125b、miR-335 mRNA相對表達水平與病變嚴重程度及活動度的相關性

CD患者外周血血清miR-125b mRNA相對表達水平與CDAI、CDEI均呈負相關(r=-0.816、-0.829，P<0.05),見圖1、2；CD患者外周血血清miR-335相對表達水平與CDAI、CDEI均呈負相關(r=-0.772、-0.501，P<0.05)。

圖1 CD患者血清miR-125b mRNA相對表達水平與疾病活動度相關性分析

圖2 CD患者血清miR-125b mRNA相對表達水平與病變 嚴重程度相關性分析

2.6 UC患者外周血血清miR-125b、miR-335 mRNA相對表達水平與病變嚴重程度及活動度的相關性

UC患者外周血血清miR-125b mRNA相對表達水平與改良Mayo評分和修正Baron評分均呈負相關(r=-0.729、-0.779，P<0.05)，見圖5、6；UC患者外周血血清中miR-335 mRNA相對表達水平改良Mayo評分和修正Baron評分均呈負相關(r=-0.819、-0.840，P<0.05)，見圖7、8。

圖3 CD患者血清miR-335 mRNA相對表達水平與疾病活動度相關性分析

圖4 CD患者血清miR-335 mRNA相對表達水平與病變嚴重程度相關性分析

圖5 UC患者血清miR-125b mRNA相對表達水平與疾病活動度相關性分析

圖6 UC患者血清miR-125b mRNA相對表達水平與病變嚴重程度相關性分析

圖7 UC患者血清miR-335 mRNA相對表達水平與疾病活動度相關性分析

圖8 UC患者血清miR-335 mRNA相對表達水平與病變嚴重程度相關性分析

3 討 論

IBD疾病是一類非特異性腸道炎癥性疾病，其病因和發病機制尚不明確[10]。近年我國該病發病率呈不斷上升趨勢[11]，給人們生活帶來嚴重危害，因此對該病發病機制的研究顯得尤為重要。本研究通過對本院117例IBD患者外周血血清和腸黏膜組織中miR-125b、miR-335表達情況進行檢測，分析外周血血清中miR-125b與miR-335表達與疾病活動度、病變嚴重程度的相關性，探索miR-125b、miR-335表達對IBD發生發展的影響，以期為臨床上更好地治療和控制IBD疾病提供參考。

miRNA是一類起始于細胞核，成熟于細胞質的非編碼單鏈RNA分子，由19～25個核苷酸組成[12]，廣泛存在于真核細胞中，在哺乳動物中成熟的miRNA可對體內60%左右的基因進行調節[13]，人類基因中有2%～3%的miRNA參與體內30%左右的基因調控，miRNA在人體所有組織及血液、尿液、唾液、腦脊液等體液中均可表達，體液中miRNA與蛋白質等構成復合物，可抵抗RNA酶的降解，使得miRNA在體液中具有高度的穩定性和保守性[14]。在健康個體中miRNA的表達譜較一致，而在不同疾病狀態下其表達譜可發生顯著變化，這種表達譜的變化往往早于生化及影像學的改變，是早期診斷疾病的理想潛在標志物。劉嫦欽等[15]報道miR-10a在IBD疾病中表達下調，對IBD的發生發展具有重要作用。SCH?NAUEN等[16]發現miR-16、miR-21和miR-223在IBD患者血清中高表達，參與調控IBD的發生發展。miR-31和miR-155通過直接和間接靶向IL-13依賴性途徑中的基因，在IBD疾病中表達上調[17]，以上均表明多種miRNA參與IBD疾病的發生發展，但目前miR-125b、miR-335在IBD疾病中研究報道較少。miR-125b是miRNAs家族中較為活躍的成員之一，其主要分布在腦部神經元細胞和星形膠質細胞中，miR-125b在調節炎癥、免疫活動和凝血方面均具有重要的作用。目前國外文獻已經證明miR-125b在UC患者結腸黏膜組織中呈高表達，其可能是通過調節炎癥信號通路MARK/NFkB等促進炎癥細胞及相關介體的傳播[18]。同時還有文獻顯示[19]，miR-125b與結直腸癌的發生發展及預后不良密切相關，其可作為結直腸癌的預后標志物。miR-335在人類定位與染色體7q32.2，其主要作用是調節人干細胞的增殖、遷移和分化，經過采用生物信息研究分析發現miR-335可能參與IBD過程，但是具體的機制尚不明確。而本研究發現，與健康對照者比較，輕度活動、中度活動、重度活動CD患者及UC患者外周血血清和腸黏膜組織中miR-335、miR-125b mRNA相對表達水平均明顯下降，提示miR-335與miR-125b表達可能與IBD發生發展過程有關。

UC是IBD的主要類型，其發病機制可能與遺傳、感染及自身免疫有關，CD是一種目前原因不明的慢性肉芽腫性炎癥性疾病，異常的自身免疫可能與發病有關[20]。UC和CD的主要區別在于UC的發病部位主要在結腸和直腸，而CD可影響整個消化道[21]，且兩者基因表達譜及細胞表現差異明顯。本研究結果顯示，UC患者外周血血清中miR-125b、miR-335 mRNA相對表達水平與Mayo評分、修正Baron評分均呈負相關；CD患者外周血血清中miR-125b、miR-335 mRNA相對表達水平與CDAI、CDEIS均呈負相關，說明外周血血清miR-125b、miR-335表達與UC患者及CD患者疾病活動度、病變嚴重程度均有關，提示外周血血清miR-125b、miR-335表達水平也許可作為評估UC患者及CD患者疾病活動度、病變嚴重程度的指標。

綜上所述，miR-125b、miR-335在UC患者及CD患者外周血血清和腸黏膜組織中表達下調，miR-125b、miR-335在外周血血清中的表達與UC患者及CD患者疾病活動度和病變嚴重程度有關，其有望成為評估IBD疾病活動度的指標，但由于本研究樣本量較少，其結論準確性尚需進一步擴充樣本量加以驗證。