伴微乳頭結構肺腺癌中c-Met、VEGF的表達及意義*

邱 靜，戴曉麗，王 琪，王婷婷，梁曉東

(1.江蘇省鹽城市第三人民醫院病理科 224000；2.江蘇醫藥職業學院，江蘇鹽城 224000)

肺癌是全球發病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，5年生存率僅有14%[1]。近年來，肺腺癌所占比率有明顯增長趨勢，目前已成為多數國家最常見的肺癌組織學亞型。肺腺癌又分為眾多亞型，其中，伴微乳頭狀結構肺腺癌(pulmonary adenocarcinoma with a micropapillary pattern,MPPAC)由AMIN等[2]在2002年首次報道，2011版肺腺癌組織學分類新標準首次將含有微乳頭結構(micropapillary pattern,MPP)≥5%遞增量的浸潤性肺腺癌單獨劃分為一個新的組織學亞型，常與肺癌的其他亞型(如貼壁生長型、腺泡型、乳頭型、實體型等)混合存在，純型罕見。與普通型肺腺癌比較，MPPAC整體預后較差，易發生淋巴結轉移及遠處轉移[3]。目前，有關MPPAC潛在分子機制尚不完全清楚。而肝細胞生長因子受體c(c-Met)為酪氨酸蛋白激酶家族成員，許多惡性腫瘤都伴有c-Met基因的擴增和過度表達[4]，c-Met信號通路有可能成為MPPAC的潛在治療靶點。此外，血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)作為重要的促血管生成因子[5]，其表達與MPPAC的關系也受到關注。目前國內對于c-Met、VEGF與MPPAC關系的研究尚少，本研究對116例肺腺癌根治標本分組進行免疫組織化學染色，比較c-Met、VEGF在MPPAC組及MPP陰性組中的表達，探討兩者表達的相關性，以及其與MPPAC患者臨床病理因素的關系，分析其在腫瘤的發生發展及侵襲轉移中的作用，為探尋有效的靶向藥物治療提供一定的理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年5月至2019年5月在江蘇省鹽城市第三人民醫院行肺癌手術切除標本116例(排除術前行放/化療及合并其他腫瘤患者)及50例癌旁正常肺組織，所有標本均經病理證實為腺癌，根據2011年發表的肺腺癌新分類診斷標準：以MPP是否大于5%將116例肺腺癌病例分為56例MPPAC組和60例MPP陰性組，50例癌旁正常肺組織為對照組。入選標本的組織學類型、分化程度及分期等均經高年資病理醫師確診。MMPAC組中男32例，女24例；年齡51～79歲，中位年齡66歲；占主要成分的腫瘤組織學分型，貼壁型2例、腺泡/乳頭型31例、實體型9例，微乳頭型14例；根據IASLC第八版國際肺癌TNM分期，Ⅰ期23例、Ⅱ期19例、Ⅲ期9例、Ⅳ期5例；無淋巴結轉移者27例，有淋巴結轉移者29例。MPP陰性組中男23例，女37例；年齡28～82歲，中位年齡63歲；占主要成分的腫瘤組織學分型，貼壁型13例、腺泡/乳頭型36例、實體型11例；根據IASLC第八版國際肺癌TNM分期，Ⅰ期29例、Ⅱ期21例、Ⅲ期7例、Ⅳ期3例；無淋巴結轉移者31例，有淋巴結轉移者29例。

1.2 方法

采用免疫組織化學SP法檢測c-Met及VEGF在各組的表達。兔抗人c-Met多克隆抗體、兔抗人VEGF單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，SP系列免疫組織化學檢測試劑盒及DAB試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。石蠟標本4 μm切片，脫蠟至水、3% H2O2封閉、高溫高壓法修復抗原、自然冷卻，滴加封閉用正常山羊血清，30 min后去山羊血清，滴加稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜，次日復溫，滴加二抗，DAB顯，蘇木素染核，脫水，封片。結果判定:相應部位出現棕黃色或棕褐色顆粒，c-Met主要表達于細胞膜和細胞質；VEGF主要表達于細胞質。評分標準：采用半定量積分法[6]。按著色強度：未著色記0分，淺黃色為弱陽性記1分；棕黃色為陽性記2分；棕褐色為強陽性記3分；每張切片選取10個高倍視野(×400)，計數陽性細胞百分比，陽性細胞所占比例小于或等于5%為0分，>5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%為3分；上述兩種評分相加，≥3分為陽性，<3分為陰性。結果由2名高年資病理醫師進行盲法判讀。

1.3 統計學處理

采用SPSS22.0軟件對數據進行分析。采用χ2比較c-Met、VEGF表達各組組織中的差異。采用Spearman等級相關分析檢驗c-Met與VEGF的表達在56例MPPAC患者中的相關性。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 MPPAC組、MPP陰性組和對照組肺組織中c-Met、VEGF的表達

c-Met陽性表達定位于細胞膜和胞質內，為棕黃色或棕褐色顆粒，其在各組中的表達情況見圖1，MPPAC組中c-Met陽性表達率為69.64%(39/56)，明顯高于MPP陰性組51.67%(31/60)和對照組6.00%(3/50)，差異有統計學意義(均P<0.05)；VEGF表達定位于細胞質內，為棕黃色或棕褐色顆粒，其在各組中的表達情況見圖2，MPPAC組中c-Met陽性表達率為66.07%(37/56)，明顯高于MPP陰性組50.00%(30/60)和對照組8.00%(4/50)，差異有統計學意義(均P<0.05)。

A:MPPAC組；B：MPP陰性組；C：對照組。

2.2 MPPAC組肺腺癌組織c-Met表達與VEGF的關系

本研究中，c-Met與VEGF在MPPAC組中共陽性表達36例，共陰性表達16例，經Spearman等級相關分析證明c-Met表達與VEGF表達呈正相關(r=0.783，P<0.01)，見表1。

表1 MPP陽性組中c-Met與VEGF蛋白表達的關系

2.3 MPPAC組肺腺癌組織中c-Met、VEGF表達與臨床病理因素的關系

MPPAC組患者組織c-Met、VEGF的表達與腫瘤的分期及有無淋巴結轉移有關(P<0.05)，而與患者性別、年齡、有無吸煙史、腫瘤大小及組織學分型無關(P>0.05)，見表2。c-Met、VEGF在MPPAC組各組織學分型中的表達見圖3、4。

表2 MPPAC組c-Met、VEGF的表達與臨床病理因素的關系

續表2 MPPAC組c-Met、VEGF的表達與臨床病理因素的關系

A:貼壁型；B：腺泡/乳頭型；C：實體型；D：微乳頭型。

A:貼壁型；B：腺泡/乳頭型；C：實體型；D：微乳頭型。

3 討 論

肺癌是目前全球第一大癌癥，在我國肺癌的發病率和病死率居于惡性腫瘤的首位。近年來，肺腺癌發病率逐年提高。MPP作為惡性腫瘤的一種特殊的病理學形態，首先在乳腺癌中被描述，含有MPP的乳腺癌發現時臨床分期較晚，預后較差[7]。MPPAC是一類浸潤程度較強、易轉移、預后差的惡性腫瘤。MPPAC可與任何一種肺腺癌組織學亞型混合存在，至今未發現單純MPPAC報道。目前對于MPPAC的研究較少，其潛在的分子機制尚不完全明確，尋找以MPPAC為主的肺腺癌發生發展和預后相關的生物學標志物，檢測癌基因與抑癌基因產物對腫瘤的影響，以尋求有效的靶向治療成為近年來研究的熱點。

c-Met基因為一種原癌基因，為肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)的唯一受體，其編碼的蛋白屬于酪氨酸激酶家族成員。活化后可激活多個下游信號通路，促進細胞的增殖、分化、抑制細胞凋亡，促進腫瘤血管生成等[8]。許多腫瘤中都伴有c-Met基因的擴增和過表達，如胃癌、結腸癌[9-10]等，c-Met陽性表達的癌細胞更具有侵襲性和遠處轉移的能力[11]，且有研究表明肺癌中Met基因擴增與分子靶向藥物的耐藥性相關[12]。

血管生成在腫瘤的生長、增殖及侵襲轉移過程中至關重要。VEGF是目前發現的作用最強的促血管內皮細胞增殖與生成因子之一，可較好地誘導血管新生。它與腫瘤血管內皮細胞相應受體結合后，可刺激腫瘤血管內皮增生，誘導血管生成，增加血管通透性等，為腫瘤的生長、浸潤和轉移提供物質基礎[5]。研究表明[13]具有MPP結構的腫瘤發生淋巴結轉移可能與腫瘤組織中的VEGF表達明顯升高有關。

本研究發現，c-Met、VEGF在MPPAC組肺腺癌中的表達明顯高于MPP陰性組肺腺癌及對照組肺組織，差異有統計學意義(P<0.05)，且在TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移的肺腺癌組織中均呈高表達，差異有統計學意義(P<0.05)，提示c-Met及VEGF的過表達與MPPAC的發生發展及侵襲轉移有關。且結果顯示c-Met、VEGF表達與患者的性別、年齡、吸煙史、腫瘤大小及組織學分型無明顯相關性。Spearman等級相關分析表明，c-Met表達與VEGF表達在MPPAC組肺腺癌組織中關系密切(r=0.783，P<0.01)。且c-Met表達與VEGF表達呈正相關，與文獻報道一致[14]，表明在MPPAC中c-Met 與VEGF均對腫瘤的發生發展存在協同作用，兩者共同參與促進腫瘤生長、增殖及調控腫瘤血管生成。研究表明[15]，c-Met活化后可促進VEGF的表達，而VEGF可促進血管內皮細胞分裂，刺激腫瘤的血管生成，故推測MPPAC易發生浸潤、淋巴結轉移及預后差可能與c-Met和VEGF在促進腫瘤血管生成方面的協同作用有關。因此，MPPAC患者中c-Met 與VEGF聯合檢測對判斷病情、指導治療、評價預后有一定價值。

綜上所述，MPPAC中c-Met、VEGF均高表達，且在有淋巴結轉移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期患者組織中表達更高，說明c-Met、VEGF在MPPAC的發生發展中可能起重要作用，其高表達可能增加MPPAC患者侵襲、轉移的風險，與患者生存率降低和預后差相關。c-Met表達與VEGF表達的相關性說明在MPPAC中c-Met 與VEGF均對腫瘤的發生發展起協同作用，c-Met可能通過促進VEGF的表達，從而促進腫瘤的增殖、遷移、侵襲及血管再生等。提示c-Met、VEGF的測定可以作為MPPAC發生發展的潛在生物標志物，對MPPAC的惡性程度及預后情況作出更加準確的判斷，為臨床診斷與治療提供依據。c-Met、VEGF信號通路可成為MPPAC治療中很有前途的靶點，抑制c-Met、VEGF的表達或許能夠延長MPPAC患者復發時間，提升總體生存期。