基于網絡藥理學的“柴胡-黃芩”藥對干預足細胞病變作用機制探索

竇一田 尚懿純 劉春柳

摘 要 目的：預測辛通暢絡法載體——復方腎蘇Ⅱ之君藥“柴胡-黃芩”藥對干預足細胞病變的可能作用靶點與機制，為辛通暢絡法防治足細胞病變序貫臨床和基礎研究的開展提供參考。方法：基于中藥系統藥理學技術平臺（TCMSP）數據庫，檢索柴胡、黃芩化學成分及其對應靶點蛋白，借助Cytoscape 3.2.1軟件繪制“中藥-成分-靶點”網絡圖。在OMIM數據庫、DrugBank數據庫及DigSee在線文本中檢索足細胞病變相關靶點，利用Venny 2.1.0在線作圖工具獲取其與“柴胡-黃芩”作用靶點的交集基因。分別應用STRING數據庫及Cytoscape 3.2.1軟件的“CytoNCA”插件構建交集基因蛋白質-蛋白質相互作用關系（PPI）網絡圖并進行拓撲學分析，獲取核心預測靶點。借助DAVID數據庫對交集基因進行基因本體（GO）功能注釋及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集，并通過OmicShare Tools在線作圖平臺實現富集結果的可視化。結果：基于TCMSP數據庫檢索結果，獲得有對應靶點的活性成分44種，其中柴胡13種、黃芩32種，豆甾醇為兩者共有成分;潛在作用靶點較多的化合物為槲皮素、山柰酚、漢黃芩素等;節點度值較高靶點蛋白為前列腺素內過氧化物合酶2（PTGS2）、PTGS1、核受體共激活因子2、熱休克蛋白90α等，分別與37、30、25、25個活性成分相關聯。獲取“柴胡-黃芩”作用靶點與足細胞病變相關靶點交集基因20個，包括PTGS2、VEGFA、MMP9、TNF、IL6等。上述交集基因的PPI網絡圖共包含節點20個、連線110條，MMP9、VEGFA、IL6等基因處于核心位置。GO分析結果顯示，共獲得生物信息條目154個（P<0.05），包括生物過程條目139個、細胞組成條目8個、分子功能條目7個。其中，生物過程主要涉及一氧化氮生物合成過程的正調控、炎癥反應、免疫反應等，細胞組成主要涉及細胞外間隙、胞外區、質膜外側等，分子功能主要涉及蛋白質結合、細胞因子活性、生長因子活性等。同時，獲得KEGG通路富集條目47個（P<0.05），主要涉及細胞因子-細胞因子受體相互作用、類風濕關節炎、瘧疾、癌癥信號通路等相關信號轉導途徑。結論：復方腎蘇Ⅱ之“柴胡-黃芩”藥對活性成分可能通過細胞因子-細胞因子受體相互作用、類風濕關節炎、瘧疾、癌癥信號通路等相關信號轉導途徑作用于MMP9、VEGFA、IL6、TNF等靶點，從而發揮對足細胞病變的干預作用。

關鍵詞 網絡藥理學;“柴胡-黃芩”藥對;足細胞病變;靶點;機制

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To predict the potential target and mechanism of Xintong Changluo Method carrier-Compund Shensu Ⅱ couplet medicine of Bupleurum falcatum-Scutellaria baicalensis intervening in podocyte lesion， and to provide reference for the development of sequential clinical and basic research of Xintong Changluo Method in the prevention and treatment of podocyte lesion. METHODS： Based on TCMSP database， chemical components and target protein of B. falcatum and S. baicalensis were retrieved， and Cytoscape 3.2.1 software was used to draw a “TCM-component-target” network. The targets related to podocyte lesion were searched from OMIM database， DrugBank database and Digsee online text， and the intersection genes of above targets and “B. falcatum-S. baicalensis” target were obtained by Venny 2.1.0 online mapping tool. The protein-protein interaction （PPI） network was constructed by STRING database， and the core targets were obtained by topology analysis of the network by using CytoNCA plug-in Cytospace 3.2.1 software. With the help of DAVID database， the function of Gene Ontology （GO） was annotated and KEGG pathway was enriched; and the enrichment results were visualized through OmicShare Tools online mapping platform. RESULTS： Based on retrieval results of TCMSP database， 44 active components were obtained， involving 13 of B. falcatum and 32 of S. baicalensis; stigmasterol is common component of B. falcatum and S. baicalensis. Quercetin， kaempferol and wogonin were the compounds with main potential targets. The target proteins with high node degree were prostaglandin endoperoxide synthase 2 （PTGS2）， PTGS1， nuclear receptor coactivator 2 and heat shock protein 90α， which were associated with 37， 30， 25 and 25 active components respectively. Twenty genes were obtained from the interaction between “B. falcatum-S. baicalensis” and podocyte lesion related targets， including PTGS2， VEGFA， MMP9， TNF and IL6. PPI network diagram of the above intersection genes contained 20 nodes and 110 lines， with MMP9， VEGFA， IL6 and other genes at the core. The results of GO analysis showed that a total of 154 biological information items were obtained （P<0.05）， including 139 biological process items， 8 cell composition items and 7 molecular function items. Among them， biological processes mainly involved in the positive regulation of NO biosynthesis process， inflammatory response， immune response. Cell composition mainly involved in extracellular space， extracellular region， external side of plasma membrane， etc.， and molecular function mainly involved in protein binding， cytokine activity， growth factor activity， etc. At the same time， 47 KEGG pathways were obtained （P<0.05）， mainly including cytokine-cytokine receptor interaction， rheumatoid arthritis， malaria， cancer signaling pathways. CONCLUSIONS： The active components of Compund Shensu Ⅱ couplet medicine of “B. falcatum-S. baicalensis” may act on MMP9， VEGFA， IL6， TNF and other targets through cytokine-cytokine receptor interaction， rheumatoid arthritis， malaria， cancer signal pathway， so as to play its intervention effect on podocyte lesion.

KEYWORDS? ?Network pharmacology; Couplet medicine of “Bupleurum falcatum-Scutellaria baicalensis”; Podocyte lesion; Target; Mechanism

生理狀態下，足細胞附著于腎小球基底膜（GBM）外側，是腎小球濾過屏障的重要組成部分;同時，作為高度特異性終末分化細胞，足細胞一旦損傷脫落就很難再生[1]。目前學者普遍認為，足細胞病變廣泛存在，是微小病變腎病、膜性腎病、局灶節段性腎小球硬化、狼瘡性腎炎以及糖尿病腎病等常見原發、繼發性腎小球疾病的共同病理改變[2]。進入21世紀后，伴隨足細胞病變概念的提出及全球足細胞病變發生率的顯著上升[3]，該病的防治日益被腎臟病專業領域的學者所關注。近年來，中醫藥對足細胞病變的防治介入廣泛，其療效確切、衛生經濟學效益較好，逐漸成為慢性腎臟病（CKD）足細胞病變綜合防治的重要組成部分[4]。但由于中醫學獨特的理論體系，其物質基礎闡釋與作用機制分析仍屬“短板”，而網絡藥理學技術的發展使特定疾病的中醫藥干預靶點與機制途徑預測成為可能[5]。鑒于此，本研究以既往證實可有效延緩足細胞病變進程的辛通暢絡法載體——復方腎蘇Ⅱ之君藥“柴胡-黃芩”藥對為例[6-7]，基于網絡藥理學技術初步探索中醫藥干預足細胞病變的針對性靶點與潛在機制，為辛通暢絡法干預足細胞病變序貫臨床與基礎研究的開展提供參考。

1 材料與方法

1.1 “柴胡-黃芩”活性成分及潛在靶點收集

研究基于中藥系統藥理學技術平臺（TCMSP）數據庫（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）進行，設置口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性指數（DL）≥0.18[8]，分別以“柴胡”“黃芩”為關鍵詞，檢索兩味藥材的化學成分及其對應靶點蛋白，并剔除無對應靶點的成分。將檢索條件設置為“Organism：Homo sapiens”，在UniProt KB數據庫（http：//www.uniprot.org/）中查詢活性成分潛在靶點蛋白的對應基因。

1.2 “中藥-成分-靶點”網絡圖構建

將“1.1”項下檢索所得的柴胡、黃芩包含的活性成分及其對應的靶點基因導入Cytoscape 3.2.1軟件中，構建“柴胡-黃芪”藥對的“中藥-成分-靶點”網絡圖，以可視化圖形直觀展示藥物成分與潛在靶點間的作用關系，并借助該軟件的“Cyto NCA”插件進行拓撲學分析。

1.3 疾病靶點基因的篩選

以“Minimal change nephropathy”“Focal segmental glomurular sclerosis”“Membranous nephropathy”“Diabetic nephropathy”等足細胞病變的相關疾病為關鍵詞，在OMIM數據庫（http：//omim.org/）、DrugBank數據庫（https：//www.drugbank.ca/）和DigSee在線文本（http：//210.107.182.61/geneSearch/）中檢索與足細胞病變相關基因。

1.4 蛋白質相互作用網絡構建

將柴胡、黃芩活性成分潛在靶點蛋白的對應基因與足細胞病變相關基因分別上傳至Venny 2.1.0在線作圖工具（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）中，繪制韋恩圖以獲取交集基因。將“柴胡-黃芩”與足細胞病變的交集基因導入STRING數據庫（https：//string-db.org）中，獲取交集基因蛋白質-蛋白質相互作用關系（PPI）網絡圖，并通過Cytoscape 3.2.1軟件的“CytoNCA”插件對PPI網絡進行拓撲學分析，獲取節點的節點度、介度性和中心緊密度等網絡拓撲特征值。其中，節點度指和該節點相關聯的邊的條數，介度性指經過網絡中某一點的最短路徑數目在所有節點的最短路徑數目中所占的比例，中心緊密度指該節點到網絡中其他所有節點的平均距離的倒數;三者的值越高表示該節點在網絡中越重要[9]。

1.5 基因本體（GO）功能注釋和京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路富集

基于DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對“柴胡-黃芩”與足細胞病變的交集基因進行GO功能注釋和KEGG通路富集分析。設置物種為“Homo sapiens（人）”，標識符（Identifier）為“Official gene symbol（官方名稱）”，保留P<0.05的富集條目，并按照P值從小到大進行排序。選擇排名前20位的條目導入OmicShare Tools在線作圖平臺（http：//www.omicshare.com/tools/index.php/），實現富集分析結果的可視化。

2 結果

2.1 “柴胡-黃芩”藥對化學成分篩選結果

基于TCMSP數據庫，在OB≥30%、DL≥0.18的篩選條件下共檢索到52種化學成分，剔出無對應靶點的化學成分后，最終共篩選得到活性化學成分44種。共有13種成分來自柴胡、32種化學成分來自黃芩，其中豆甾醇為柴胡、黃芩相同成分。“柴胡-黃芩”活性化學成分基本信息詳見表1。

2.2 “中藥-成分-靶點”網絡圖分析結果

“柴胡-黃芪”藥對的“中藥-成分-靶點”網絡圖詳見圖1[圖中，節點代表中藥及其對應的活性成分（活性成分標簽由M+TCMSP編號最后4/5位數字表示）、靶點蛋白，連線代表中藥與活性成分、活性成分與潛在靶點間的關系]。由圖1所知，該圖共包含節點267個、連線834條。其中，中藥節點2個、活性成分節點44個、靶點蛋白節點221個。拓撲學分析結果顯示，該網絡中潛在作用靶點較多的化合物為槲皮素、山柰酚、漢黃芩素、黃芩素、β-谷甾醇等，節點度值依次為149、51、45、37、37;節點度值較高靶點蛋白依次為前列腺素內過氧化物合酶2（PTGS2，又稱COX-2）、PTGS1、核受體共激活因子2（NCOA2）、熱休克蛋白90α（HSP90α）、雄激素受體（AR）等，分別與37、30、25、25、22個活性成分相關聯。

2.3 “柴胡-黃芩”作用靶點與足細胞病變相關靶點交集基因篩選結果

經檢索獲取足細胞病變相關基因140個、柴胡作用靶點186個、黃芩作用靶點119個。將其導入Venny2.1.0在線作圖工具制作韋恩圖（見圖2）后，獲取“柴胡-黃芩”作用靶點與足細胞病變交集基因20個，其中9個為柴胡與黃芩共同作用靶點[PTGS2、VEGFA、MMP9、TNF、IL6、MCP1（又稱CCL2）、TGFB1、IL8（又稱CXCL8）、CDKN1A]。

2.4 PPI網絡的構建與分析結果

“柴胡-黃芩”作用靶點與足細胞病變相關靶點交集基因的PPI網絡圖見圖3（圖中，節點表示交集基因對應蛋白，每條邊表示PPI關系）。拓撲學分析結果顯示，該網絡圖包含節點20個、連線110條;根據中心度、介度性、中心緊密度等參數判定，MMP9、VEGFA、IL6、TNF、PTGS2等基因處于核心位置，其拓撲學參數詳見表2（由于RUNX1T1未與其他蛋白相連，故表中無其參數）。

2.5 GO基因注釋與KEGG通路富集結果

通過GO基因注釋分析得到154個條目（P<0.05），包括生物過程條目139個、細胞組成條目8個、分子功能條目7個。生物過程主要以一氧化氮生物合成過程的正調控、炎癥反應、免疫反應等為主要富集條目;細胞組成主要涉及細胞外間隙、胞外區、質膜外側等;分子功能主要涉及蛋白質結合、細胞因子活性、生長因子活性等，詳見表3、表4、表5。

KEGG通路富集獲得條目47個（P<0.05）。其中，主要富集條目為細胞因子-細胞因子受體相互作用、類風濕關節炎、瘧疾、癌癥信號通路等。“柴胡-黃芪”作用靶點與足細胞病變相關靶點交集基因的KEGG通路富集分析結果（前20位）見圖4（圖中，縱坐標為通路名稱，橫坐標為富集因子，氣泡大小表示富集于該條目上的基因個數，氣泡越大，表示該條目富集個數越多;氣泡顏色表示P值），KEGG通路富集信息表（前20條）見表6。

3 討論

辛通暢絡法系天津市名中醫曹式麗教授的特色中醫腎病學術觀點。在前期臨床與基礎研究過程中，本課題組以具有典型足細胞病變特征的局灶節段性腎小球硬化（FSGS）模型大鼠為研究對象，以辛通暢絡法之載體——復方腎蘇Ⅱ的相關作用機制闡釋為切入點，開展了系列研究，證實了復方腎蘇Ⅱ可有效減少FSGS模型大鼠尿蛋白排泄，有效延緩足細胞形態變化及凋亡進程[6，10-11]。同時，本課題組基于系膜增生性腎小球腎炎（MsPGN）大鼠模型的研究結果表明，復方腎蘇Ⅱ可有效調控IL6介導的腎組織免疫損傷[12]。盡管辛通暢絡法系列研究的前期結果已提示復方腎蘇Ⅱ具有多相調控足細胞病變的可能性，但現有研究內容往往是根據跟蹤現代醫學、分子生物學相關機制新發現而確定的，難免存在“散、淺、雜”的局限性，科研思路與研究內容亟待創新、優化。復方腎蘇Ⅱ之君藥“柴胡-黃芩”系曹式麗教授蛋白尿中醫臨證治療之“辛通暢絡”常用藥對，且其單體成分亦是復方腎蘇Ⅱ的重要藥效成分[13];加之柴胡、黃芩所具有的廣泛生物活性，涵蓋抗氧化、抑制環氧合酶、抗炎等多種藥理作用，且二味藥材配伍后應用，可增加柴胡皂苷、黃芩苷等有效成分的溶出，增強抗炎、抗氧化等藥理效應[14]。因此，筆者認為，通過網絡藥理學技術進行復方腎蘇Ⅱ之君藥“柴胡-黃芩”藥對干預足細胞病變潛在靶點的預測，存在提升科研創新能力、進而拓展該方整體科研思路與內容的可能性。

一般認為，正常足細胞由胞體、主突及足突構成。其中，相鄰足突交錯錨定于GBM，并形成裂孔隔膜（SD）。SD由基因、細胞活性因子及信號通路等多層次調控，以防止大分子蛋白漏出[15]。病理狀態下，以細胞骨架重構、黏附性降低、遷移性升高以及凋亡發生為主要表現的足細胞病變將最終導致足細胞自GBM脫落[16];與此同時，殘存的足細胞由于胞體的代償性肥大、足突的增寬融合、腎小球濾過屏障通透性的異常增加，從而導致蛋白尿的產生[17]。上述足細胞病變特點是闡釋“柴胡-黃芩”乃至復方腎蘇Ⅱ足細胞病變防治機制的重要切入點。

本研究結果表明，槲皮素、山柰酚、漢黃芩素、黃芩素、β-谷甾醇等作用靶點較多，為“柴胡-黃芩”主要活性成分。PPI拓撲學分析結果顯示，MMP9、VEGFA、IL6、TNF、PTGS2（又稱COX-2）等靶點處于網絡核心位置。目前認為，腎臟基質金屬蛋白酶9（MMP9）多源于足細胞，MMP9基因啟動子位點的特異性去甲基化參與并調節了高糖培養基中人足細胞上皮細胞向間充質細胞轉分化（EMT）的發生[18];IL6作為重要炎癥因子，可通過信號轉導及轉錄激活因子3/肌球蛋白輕鏈阻斷局部黏著斑動態，破壞細胞骨架組織，導致足細胞遷移運動增加[19];VEGFA與足細胞損傷密切相關，其可通過調控足細胞標志蛋白Nephrin的表達而誘導足突融合[20];TNF與足細胞功能障礙和凋亡密切相關，其功能喪失可顯著逆轉足細胞凋亡[21]。此外，COX-2為腎血流動力學及炎癥反應的關鍵調節因子，在足細胞損傷時異常激活，故抑制COX-2的表達可使足細胞免受損傷[22]。以上內容提示，柴胡、黃芩活性成分可能主要通過調控上述靶點來實現對足細胞骨架損傷、遷移、凋亡及炎癥反應等病理進程的多相調控。

信號通路作為細胞外分子信號經細胞膜傳入細胞內發揮效應的一系列酶促反應，在諸多生理、病理過程中發揮重要作用[23]。KEGG通路富集結果顯示，癌癥、細胞因子-細胞因子受體相互作用、類風濕關節炎、瘧疾、乙型肝炎等相關信號通路可能是“柴胡-黃岑”藥對干預足細胞病變的主要調節通路。Toll樣受體（TLR）信號通路作為炎癥反應的經典信號通路之一，是瘧疾、類風濕關節炎等疾病的重要調節機制，亦與NF-κB信號通路共同參與足細胞損傷過程[24-25]。嘌呤霉素氨基核苷可導致體外培養的足細胞中TLR4表達量增多，進而導致NF-κB活化，誘發炎癥反應[26];反之，NF-κB的活化亦可促進足細胞TLR4高表達，導致炎性損傷[27]。既往研究顯示，TGF信號通路參與細胞生長、分化、凋亡等多個細胞過程[28]，從屬于癌癥、細胞因子-細胞因子受體相互作用等信號通路[29-30]。有研究指出，在高糖刺激下，TGF-β/Smad信號通路激活，可誘導足細胞凋亡[31]。磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）作為細胞生長、代謝、凋亡重要通路，是常見的癌癥信號通路[32]。在足細胞病變中，由CD2相關蛋白（CD2AP）介導PI3K募集于質膜，并刺激足細胞中PI3K依賴的Akt信號轉導，誘導足細胞結構、功能完整性損傷，甚至凋亡[33]。前期辛通暢絡法系列研究結果表明，復方腎蘇Ⅱ可通過抑制Notch-PI3K/Akt通路異常激活，逆轉足細胞EMT進程，修復足細胞損傷[11]，這在一定程度上提升了其他KEGG富集通路預測結果的可靠性。

綜上所述，本研究運用網絡藥理學方法，通過對冗繁數據信息的整合分析，初步實現了對“柴胡-黃芩”干預足細胞病變可能靶點、機制途徑與生物過程的預測。然而，網絡藥理學尚處于探索階段，數據來源僅限于在線開源數據庫，其數據涵蓋范圍與可靠性仍有待提高，靶點蛋白及其與信號通路間的作用機制尚處于生物信息分析層面，仍需基礎與臨床研究予以進一步驗證。

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（收稿日期：2020-10-15 修回日期：2021-01-08）

（編輯：林 靜）