UPLC-MS/MS法同時測定人血漿中5-FU及其代謝產物5-FUH2的濃度及應用

佟志強 吳東媛 張娟 程夢飛 張碩 董梅

摘 要 目的：建立同時測定人血漿中5-氟尿嘧啶（5-FU）及其代謝產物5-氟-5，6-二氫尿嘧啶（5-FUH2）濃度的方法，并應用于臨床。方法：血漿樣品經乙酸乙酯二次萃取處理后，以5-溴尿嘧啶（5-Bru）為內標，采用超高效液相色譜-串聯質譜技術（UPLC-MS/MS）測定。色譜柱為Acquity UPLC HSS T3，流動相為甲醇-水（30 ∶ 70，V/V），流速為0.3 mL/min，柱溫為20 ℃，進樣量為5 μL。采用電噴霧離子源，以多反應監測進行負離子掃描，毛細管電壓為1.5 kV，錐孔電壓為20 V，脫溶劑溫度為450 ℃，脫溶劑氣流為850 L/h，錐孔氣流速為50 L/h;用于定量分析的離子對分別為m/z 129.00→41.90（5-FU）、m/z 130.87→82.92（5-FUH2）、m/z 189.00→42.10（5-Bru）。選擇2020年8-10月哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院接受5-FU持續靜脈滴注46 h為基礎化療方案治療的晚期結直腸癌患者10例，測定其持續靜脈滴注18～30 h時的5-FU穩態血藥濃度及5-FUH2血藥濃度，計算5-FU藥-時曲線下面積（AUC）和5-FUH2/5-FU濃度比值。結果：5-FU、5-FUH2檢測質量濃度的線性范圍均為20～1 000 ng/mL（R 2均大于0.990），定量下限均為20 ng/mL;精密度試驗的RSD均小于20%，相對誤差在±10%范圍內;提取回收率、基質效應均不影響待測物的測定。10例晚期結直腸癌患者中，5-FU穩態血藥濃度為180.04～622.83 ng/mL，AUC為8.28～28.65 mg·h/L;5-FUH2血藥濃度為336.48～948.43 ng/mL;5-FUH2/5-FU濃度比值為0.93～4.21;10例患者的5-FU AUC存在約3～4倍的個體差異。結論：所建方法精密度、準確性均較好，靈敏度較高且操作簡便，可用于晚期結直腸癌患者體內5-FU血藥濃度的監測。

關鍵詞 超高效液相色譜-串聯質譜法;5-氟尿嘧啶;5-氟-5，6-二氫尿嘧啶;血藥濃度

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the method for simultaneous determination of 5-fluorouracil （5-FU） and its metabolites 5-fluoro-5，6-dihydrouracil （5-FUH2） in human plasma， and apply it in the clinic. METHODS： After plasma samples were processed twice by ethyl acetate， UPLC-MS/MS method was adopted using 5-bromouracil （5-Bru） as internal standard. The determination was performed on Acquity UPLC HSS T3 column with mobile phase consisted of methanol-water （30 ∶ 70， V/V） at the flow rate of 0.3 mL/min. The column temperature was 20 ℃， and sample size was 5 μL. An electrospray ion source was used to carry out negative ion scanning with multiple reaction monitoring. The capillary voltage was 1.5 kV; the taper hole voltage was 20 V; the desolvent temperature was 450 ℃; the desolvent air flow was 850 L/h; the cone hole gas velocity was 50 L/h. The ion transitions for quantitative analysis were m/z 129.00→41.90（5-FU），m/z 130.87→82.92（5-FUH2）， m/z 189.00→42.10（5-Bru）， respectively.? From Aug. to Oct. 2020， 10 patients with advanced colorectal cancer were treated with continuous intravenous drip of 5-FU for 46 hours were collected from Harbin Medicinal University Cancer Hospital. Steady-state plasma concentration of 5-FU and plasma concentration of 5-FUH2 were determined at 18-30 h of continuous intravenous drip. The area under the curve （AUC） for 5-FU and concentration ratio of 5-FUH2/5-FU were calculated. RESULTS： The linear range of 5-FU and 5-FUH2 were 20 to 1 000? μg/mL （R 2>0.990）. The quantification limits were 20 ng/mL. RSDs of precision test were all lower than 20%， and relative error ranged ±10%. The extraction recovery and matrix effects didnt affect the determination of substance to be measured. Among 10 patients with advanced colorectal cancer， the steady-state concentration of 5-FU were 180.04-622.83 ng/mL， and AUC of 5-FU ranged from 8.28 to 28.65 mg·h/L. The concentration of 5-FUH2 ranged 336.48-948.43 ng/mL， and concentration ratio of 5-FUH2/5-FU ranged 0.93-4.21. AUC of 5-FU in 10 patients had about 3-4 fold individual differences. CONCLUSIONS： The established method has good precision and accuracy， high sensitivity， and simple operation. It can be used for plasma monitoring of 5-FU in patients with advanced colorectal cancer.

KEYWORDS? ?UPLC-MS/MS; 5-FU; 5-FUH2; Plasma concentration

氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）可同時抑制腫瘤細胞DNA和RNA的合成，是晚期結直腸癌患者化療的基石[1-3]。其作為抗代謝類細胞毒性藥物，治療窗相對較窄，能在濃度暴露水平重疊的情況下發揮療效并產生毒性[4]。在臨床應用中，5-FU和卡培他濱、奧沙利鉑等化療藥物相似，其給藥劑量均根據患者的體表面積（BSA）確定。但有研究發現，基于BSA給藥時，5-FU體內清除率存在較大的個體差異，差異高達10～100倍[5]。目前，5-FU的治療藥物監測（TDM）研究發現，藥動學參數藥-時曲線下面積（AUC）與療效和安全性具有相關性，在5-FU持續靜脈滴注的方案中，5-FU AUC可以用5-FU穩態血藥濃度（css）和持續靜脈滴注時間（TCI）的乘積來計算[4]。由此，筆者認為基于5-FU 的AUC來調整其臨床劑量是可行的。

二氫嘧啶脫氫酶（DPD）可清除體內80%～90%的5-FU，是該藥體內分解代謝的關鍵限速酶[4]。有研究表明，一般人群中，DPD酶活性偏低和完全缺乏者分別占全部人群的3%～5%和0～0.1%，DPD酶活性偏低或缺乏會造成患者體內5-FU血藥濃度升高而致蓄積中毒，從而引發嚴重的骨髓抑制和胃腸道反應等，因此DPD酶活性是預測5-FU相關不良反應的生物標志物之一[4-6]。DPD酶由DPYD基因編碼，目前除檢測患者DPYD基因多態性外，還可將二氫尿嘧啶（UH2）/尿嘧啶（U）濃度比值或5-氟-5，6-二氫尿嘧啶（5-FUH2）/5-FU濃度比值作為DPD酶活性的表型指標[4]。5-FUH2是5-FU在體內經DPD酶分解產生的主要代謝產物，已有研究證實，5-FUH2的血藥濃度與5-FU引起的不良反應具有相關性[7-8]。因此，測定5-FU和5-FUH2血藥濃度既可用于計算5-FU的AUC，又可用于評估DPD酶活性。

目前，5-FU TDM的常用方法包括高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）和免疫分析法，其中HPLC法和LC-MS/MS法是測定5-FU血藥濃度的經典方法，準確度、靈敏度較高，但分析速度較慢[9-10]。超高效液相色譜-串聯質譜技術（UPLC-MS/MS）具有較高的準確度和靈敏度，且分析時間較短，更適合于臨床樣本的批量檢測[4]?；诖?，本研究建立了同時測定人血漿中5-FU和5-FUH2濃度的UPLC-MS/MS法;同時，采用該方法對哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院使用以5-FU為基礎化療方案的晚期結直腸癌患者的5-FU和5-FUH2血藥濃度進行檢測，并計算5-FU的AUC，旨在為調整下一周期5-FU的化療劑量調整以及患者的個體化用藥提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

實驗所用主要儀器有：Waters ACQUITY H-Class型UPLC儀（配有UPLC系統和質譜檢測器）、Waters Xevo TQ-MS檢測器（美國Waters公司），TI-H20型多頻超聲波清洗儀（德國ELMA公司），BS14-TM-1F型數顯渦旋震蕩器（德國WIGGENS公司），D-35720型低溫高速離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司），EX324型十萬分之一電子天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司]，JT-DCY-12SL型水浴氮吹儀（杭州聚同電子有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

實驗所用主要藥品與試劑有：5-FU對照品（上海麥克林生化科技有限公司，批號F100149，純度99%）、5-FUH2對照品（美國Cayman公司，批號0496883-6，純度99%）、5-溴尿嘧啶對照品（5-Bru，內標，美國Sigma-Aldrich公司，批號852473，純度98%）等;人空白血漿由哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院提供;甲醇、乙腈、甲酸均為質譜級，乙酸乙酯為色譜純，水為去離子水。

2 方法與結果

2.1 色譜與質譜條件

2.1.1 色譜條件 以Acquity UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）為色譜柱，以甲醇-水（30 ∶ 70，V/V）為流動相，流速為0.3 mL/min，柱溫為20 ℃，進樣量為5 μL。

2.1.2 質譜條件 離子源為電噴霧離子源（ESI），掃描模式為多反應監測（MRM） 模式，掃描方式為負離子模式，毛細管電壓為1.5 kV，錐孔電壓為20 V，脫溶劑溫度為450 ℃，脫溶劑氣流為850 L/h，錐孔氣流速為50 L/h;用于定量分析的離子對分別為m/z 129.00→41.90（5-FU）、m/z 130.87→82.92（5-FUH2）、m/z 189.00→42.10（5-Bru）。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取5-FU、5-FUH2對照品各10.00 mg，分別置于100 mL棕色量瓶中，加50%甲醇定容，混勻，制成5-FU、5-FUH2質量濃度均為100 mg/L的單一對照品貯備液。精密吸取上述各單一對照品貯備液適量，分別加50%甲醇稀釋，制成5-FU、5-FUH2質量濃度均為10 mg/L的單一對照品溶液，置于4 ℃冰箱中保存，備用。

2.2.2 內標溶液 精密稱取5-Bru對照品10.00 mg，置于100 mL棕色量瓶中，加50%甲醇定容，混勻，制成質量濃度為100 mg/L的5-Bru貯備液。精密吸取上述貯備液適量，加50%甲醇稀釋，制成質量濃度為2 000 ng/mL的內標溶液，置于4 ℃冰箱中保存，備用。

2.2.3 質控樣品溶液 取“2.2.1”項下5-FU、5-FUH2單一對照品溶液適量，分別加空白血漿稀釋，制成質量濃度分別為20、50、400、800 ng/mL的5-FU、5-FUH2質控樣品溶液。

2.3 血漿樣品的處理

取空白血漿適量，置于37 ℃水浴中融解，精密吸取200 μL，置于1.5 mL離心管中，加“2.2.2”項下內標溶液25 μL，渦旋30 s，混勻，加乙酸乙酯1 mL，渦旋1 min;于4 ℃下以14 600 r/min離心10 min，吸取上清液500 μL，置于另一1.5 mL 離心管中;在原離心管中再加乙酸乙酯500 μL，渦旋30 s，于4 ℃下以14 600 r/min離心10 min，吸取全部上清液;合并兩次上清液，置于40 ℃水浴中以氮氣流吹干，殘渣加流動相100 μL復溶，渦旋2 min，經0.45 μm濾膜濾過，取續濾液，置于自動進樣瓶中備測。

2.4 專屬性考察

分別取空白血漿、空白血漿+5-FU+5-FUH2+內標、晚期結直腸癌患者血漿樣品+內標，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結果，5-FU、5-FUH2、5-Bru的保留時間分別為1.22、1.18、1.55 min;空白血漿中的內源性物質（如自身體內的神經遞質、激素等）對5-FU、5-FUH2的測定無干擾，色譜峰峰形對稱、特異性好，分離度均大于>1.5，詳見圖1（空白血漿圖略）。

2.5 線性關系考察

分別取“2.2.1”項下5-FU、5-FUH2對照品溶液適量，加50%甲醇稀釋，制成質量濃度分別為100、250、500、1 000、2 000、2 500、3 750、5 000 ng/mL的5-FU、5-FUH2系列溶液。分別精密吸取上述系列溶液各40 μL，加“2.2.2”項下內標溶液20 μL，于40 ℃下以氮氣流吹干后，殘渣加空白血漿200 μL，制成質量濃度分別為20、50、100、200、400、500、750、1 000 ng/mL的5-FU、5-FUH2系列單一線性工作溶液，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄峰面積。以待測成分的質量濃度（X，ng/mL）為橫坐標、待測成分與內標的峰面積比值（Y）為縱坐標進行線性回歸，得5-FU的回歸方程為Y=0.014 4X-0.065 4（R 2=0.998 7）、5-FUH2的回歸方程為Y=0.002 1X-0.010 3（R 2=0.996 1），表明5-FU、5-FUH2檢測質量濃度的線性范圍均為20～1 000 ng/mL，定量下限均為20 ng/mL。

2.6 精密度與準確度試驗

分別取“2.2.3”項下20、50、400、800 ng/mL的5-FU、5-FUH2質控樣品溶液，每個質量濃度各取5份，分別于1 d內按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜與質譜條件連續進樣分析，考察日內精密度;連續3 d按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，考察日間精密度。以實測質量濃度與理論質量濃度進行比較，用相對誤差（RE）來考察準確度。結果，5-FU和5-FUH2日內、日間精密度均小于20%，RE在±10%范圍內，符合體內生物樣品定量分析的要求[11]，詳見表1。

2.7 穩定性試驗

分別取“2.2.3”項下50、400、800 ng/mL的5-FU、5-FUH2質控樣品溶液，每個質量濃度各取5份，分別于室溫下放置 24 h、低溫（4 ℃）下放置24 h、-80 ℃冷凍保存30 d、3次凍融循環（-20 ℃～室溫）、在自動進樣器中放置 24 h后，按“2.3”項下方法處理，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄峰面積。以實測質量濃度與理論質量濃度進行比較，用RE來考察穩定性。結果，RE在±7%范圍內，提示樣品在上述條件下穩定性良好詳見表2。

2.8 提取回收率和基質效應考察

取“2.2.3”項下50、400、800 ng/mL的5-FU質控樣品溶液，每個質量濃度各取5份，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，測得5-FU質控樣品/5-Bru峰面積的比值（A）;另取空白血漿適量，按“2.3”項下方法處理后，取上清液適量，加5-FU對照品溶液適量，制成質量濃度分別為50、400、800 ng/mL的對照品樣品，每個質量濃度各取5份，按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，測得5-FU對照品樣品/5-Bru峰面積比值（B）;按“2.2.3”項下方法，將空白血漿改為50%甲醇制成質量濃度為分別為50、400、800 ng/mL的5-FU甲醇樣品，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，測得5-FU甲醇樣品/5-Bru峰面積比值（C）。提取回收率=A/B×100%，基質效應=B/C×100%。5-FUH2按上述同法操作。結果，5-FU的平均提取回收率為52.93%～58.89%（RSD≤5.89%），平均基質效應為99.40%～102.31%（RSD≤7.65%）;5-FUH2的平均提取回收率為54.60%～62.01%（RSD≤8.08%），平均基質效應為97.21%～101.87%（RSD≤7.57%），均符合體內生物樣品定量分析的要求[11]，詳見表3。

2.9 臨床應用

2.9.1 納入與排除標準 納入標準：（1）經組織病理學和/或細胞生物學檢查確診為晚期結直腸癌;（2）至少有1個可測量的病灶;（3）美國東部腫瘤協作組（EGCO）全身狀態評分為0～1分;（4）接受以5-FU為基礎藥物持續靜脈滴注的全身化療方案;（5）血常規、肝腎功能等檢查均符合化療標準;（6）預期生存時間≥12周;（7）年齡18～80歲;（8）體質量≥40 kg。排除標準：（1）妊娠期或哺乳期或有妊娠可能的女性患者，首次用藥前妊娠檢測呈陽性者;（2）具有臨床意義的電解質異常者;（3）既往或現在存在中樞神經系統轉移或腦轉移者;（4）存在臨床可檢查出的第二原發惡性腫瘤，或在過去5年內出現過其他惡性腫瘤（已充分治療的皮膚基底細胞癌或宮頸原位癌除外） 者;（5）有未控制的活動性感染（如急性肺炎、乙肝或丙肝活動期）者;（6）有消化道疾病或研究者判定的可能引起消化道出血或者穿孔的其他狀況，或既往有腸穿孔、腸瘺史者;（7）入組前6個月內有動脈血栓或深靜脈血栓史，或入組前2個月內有出血傾向證據或病史且無論嚴重程度如何者;（8）部分凝血酶原時間或凝血酶原時間超出正常值1.5倍者;（9）入組前6個月內有急性心肌梗死、嚴重/不穩定心絞痛或者冠狀動脈搭橋術史、或美國紐約心臟病協會（NYHA）心功能分級2級及以上者;（10）嚴重心理疾病或精神異常者;（11）既往4周內參加過其他藥物臨床試驗者;（12）正在其他臨床試驗中接受其它藥物治療者。

2.9.2 一般資料 收集2020年8-10月于哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院接受以5-FU持續靜脈滴注46 h為基礎化療方案治療的晚期結直腸癌患者10例，其中男性7例、女性3例，平均年齡（57.5±5.6）歲。本研究方案經哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院醫學倫理委員會批準（倫理批號KY2017-18），所有患者均簽署了知情同意書。

2.9.3 檢測結果 所有患者于5-FU持續靜脈滴注18～30 h時采集外周靜脈血，置于乙二胺甲乙酸二鉀抗凝管中，采樣后立即置于冰浴中，并于4 ℃以3 000 r/min離心10 min，將上層血漿置于-80 ℃保存。按本研究所建方法檢測患者5-FU的css和5-FUH2的血藥濃度，并按公式計算患者5-FU的AUC：AUC=css×TCI[4]。結果，5-FU的css為180.04～622.83 ng/mL，5-FU的AUC為8.28～28.65 mg·h/L，其AUC可達3～4倍個體差異;5-FUH2的血藥濃度為336.48～948.43 ng/mL;5-FUH2/5-FU濃度比值為0.93～4.21。這提示不同患者個體間5-FU的AUC暴露量差異較大。晚期結直腸癌患者5-FU AUC暴露散點圖和5-FUH2/5-FU濃度比值分布圖分別見圖2、圖3。

3 討論

5-FU的分子式為C4H3FN2O2，分子量為130.08;5-FUH2的分子式為C4H5FN2O2，分子量為132.08，均為小分子物質，加之兩者親水性強，因此在選擇色譜柱時應注意選擇適用于水溶性物質分離的色譜柱[12]。本研究前期試驗曾嘗試Waters UPLC BEH C18色譜柱，結果發現，5-FU和5-FUH2在C18色譜柱上保留時間極短（<0.5 min），分離效果不理想。經查閱資料后發現，T3柱是一種可以耐受100%水相且可長時間沖洗的特殊色譜柱，其鍵合相由多孔硅膠基質組成，可延長極性組分的保留時間[13]，故本研究選用Acquity UPLC HSS T3小顆粒填料色譜柱。

因5-Bru與5-FU、5-FUH2具有相同的母核，只有鹵素取代不同，本研究前期試驗結果顯示，5-Bru在離子化和色譜保留方面均對5-FU、5-FUH2的測定無干擾，方法學驗證也滿足生物樣本定量分析的要求[11]，故選擇5-Bru為內標。與現有文獻相比，本研究所建UPLC-MS/MS法分析時間短、血漿用量少、定量下限更低，且不需要使用同位素標記的內標，因此在臨床5-FU的TDM應用中更有優勢[12-13]。

本研究發現，不同患者個體間5-FU和5-FUH2血藥濃度暴露量差異較大，5-FU AUC差異可達3～4倍，推測其原因可能與個體間DPD酶的活性不同有關。有研究認為，5-FU AUC在 20～30 mg·h/L范圍內療效最好且不良反應發生率最低[4]，但僅有約25%患者能達到上述有效治療范圍，約10%～20%患者會因血藥濃度較高而導致嚴重的不良反應發生[5-6]。而本研究中，有5例患者的5-FU AUC在20～30 mg·h/L范圍內，且未見嚴重不良反應發生;有5例患者的5-FU AUC 小于20 mg·h/L，也未見嚴重不良反應發生;另外，雖然有2例患者的5-FUH2/5-FU濃度比值小于1，但均未觀察到3/4級不良反應發生，其關聯性尚需擴大樣本量進一步研究。

綜上所述，所建方法精密度、準確性均較好，靈敏度較高且操作簡便，可用于晚期結直腸癌患者體內5-FU血藥濃度的監測。

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（收稿日期：2020-10-23 修回日期：2021-01-05）

（編輯：陳 宏）