愈瘍膠囊對細菌感染皮炎模型大鼠的抗炎作用及對TLR/NF-κB通路的影響

羅倫才 童妍 張興國 陳礴 鐘振東

摘 要 目的：研究愈瘍膠囊對細菌感染皮炎模型大鼠的抗炎作用及對Toll樣受體/核因子κB（TLR/NF-κB）通路的影響。方法：采用肉湯稀釋法測定愈瘍膠囊對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）。將50只大鼠隨機分為模型組、陽性對照組（阿莫西林克拉維酸鉀，以阿莫西林計120 mg/kg）和愈瘍膠囊高、中、低劑量組（根據(jù)MIC設(shè)定），每組10只。以金黃色葡萄球菌感染大鼠燒傷皮膚構(gòu)建細菌感染皮炎模型。造模成功24 h后，各藥物組大鼠灌胃相應(yīng)藥物，模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)7 d。計算給藥第1、3、5、7天各組大鼠皮膚愈合率并記錄創(chuàng)面結(jié)痂、脫痂、愈合情況;使用酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測皮膚組織中白細胞介素1β（IL-1β）、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、羥脯氨酸（HYP）、膠原蛋白Ⅰ（Col Ⅰ）、Col Ⅲ的含量;使用蘇木精-伊紅染色法觀察皮膚組織形態(tài)學變化，并使用透射電子顯微鏡觀察超微結(jié)構(gòu);采用Western blotting法檢測皮膚組織中Toll樣受體2（TLR2）、TLR4與磷酸化-NF-κB-p65（p-NF-κB p65）蛋白表達水平。結(jié)果：愈瘍膠囊的MIC與MBC分別為25 mg/mL和50 mg/mL，愈瘍膠囊高、中、低劑量組分別設(shè)為600、300、150 mg/kg。與模型組比較，愈瘍膠囊高、中劑量組大鼠給藥3 d后傷處皮膚出現(xiàn)結(jié)痂，給藥5～7 d后部分大鼠傷處出現(xiàn)脫痂;陽性對照組和愈瘍膠囊高、中劑量組大鼠各時間點的皮膚愈合率均顯著升高，IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α含量和病理評分以及TLR2、TLR4、p-NF-κB p65蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），皮膚組織炎細胞浸潤等病理改變好轉(zhuǎn);陽性對照組和愈瘍膠囊高劑量組大鼠的HYP、Col Ⅰ、Col Ⅲ含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。而陽性對照組和愈瘍膠囊高、中劑量組上述指標差異大多無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)論：愈瘍膠囊可促進細菌感染皮炎模型大鼠皮膚愈合，具有一定的抗炎作用，其機制可能與抑制TLR/NF-κB信號通路、減少炎癥反應(yīng)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 愈瘍膠囊;細菌感染;感染性皮炎;Toll樣受體/核因子κB信號通路;抑菌抗炎;大鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the anti-inflammatory effects of Yuyang capsule on bacterial dermatitis model rats and its effect on TLR/NF-κB pathway. METHODS： Minimum inhibition concentration （MIC） and minimal bactericidal concentration （MBC） of Yuyang capsule against Staphylococcus aureus were determined by microdilution test. Totally 50 SD rats were randomly divided into model group， positive control group （amoxicillin and clavulanate potassium， 120 mg/kg as amoxicillin）， Yuyang capsules high-dose， medium-dose and low-dose groups （according to MIC）， with 10 rats in each group. The model of bacterial dermatitis was established by using the burned skin of rats infected with S. aureus. 24 h after modeling， administration groups were intragastrically given the corresponding drug， and model group was intragastrically given the same amount of normal saline， once a day， for consecutive 7 days. The skin healing rate was calculated on the 1st， 3rd， 5th and 7th day of administration， and the scab formation， decrustation and healing were recorded. The contents of IL-1β， IL-6， IL-10， TNF-α， hydroxyproline （HYP）， collagen Ⅰ （Col Ⅰ） and Col Ⅲ in skin tissue were detected by ELISA. Morphology changes of skin tissues were observed by HE staining. The ultrastructure was observed by transmission electron microscope. Protein expression of TLR2， TLR4 and p-NF-κB p65 were detected by Western blotting assay. RESULTS： MIC and MBC of Yuyang capsule were 25 mg/mL and 50 mg/mL， respectively. Dose of Yuyang capsules high-dose， medium-dose and low-dose groups were set at 600， 300， 150 mg/kg. Compared with model group， scab appeared on the injured skin 3 days after administration in Yuyang capsule high-dose and medium-dose groups， and decrustation appeared on the injured skin of part mice 5-7 days after administration; the skin healing rate of the positive control group， Yuyang capsule high-dose and medium-dose groups were all significantly increased at each time point. The contents of IL-1β， IL-6， IL-10 and TNF-α， pathological score， protein expression of TLR2， TLR4 and p-NF-κB p65 were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）; the pathological changes such as inflammatory cell infiltration in skin tissue were improved. The contents of HYP， Col Ⅰ and Col Ⅲ were increased significantly in positive control group and Yuyang capsule high-dose group （P<0.05 or P<0.01）. There was no statistical significance in most above indexes in positive control group， Yuyang capsule high-dose and medium-dose groups （P>0.05）. CONCLUSIONS： Yuyang capsule can promote skin healing of bacterial dermatitis model rats and shows certain anti-inflammatory effects; the mechanism may be related to inhibiting TLR/NF-κB signaling pathway and reducing inflammatory response.

KEYWORDS? ?Yuyang capsules; Bacterial infection; Infectious dermatitis; TLR/NF-κB signaling pathway; Antibacterial and anti-inflammatory; Rat

金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus是一種革蘭氏陽性菌，常在人前鼻孔和皮膚中定植，是絕大多數(shù)皮膚和軟組織感染的主要病原體[1]。金黃色葡萄球菌可導致多種感染，是造成慢性創(chuàng)面皮膚傷口感染的主要原因之一，也是引起術(shù)后感染性并發(fā)癥的關(guān)鍵[2]。目前臨床治療金黃色葡萄球菌感染主要以抗生素為主，但存在細菌耐藥的風險[3]。因此，尋找新的有效的抗菌制劑就變得十分重要。

愈瘍膠囊是涼山彝族自治州第二人民醫(yī)院獨具特色的院內(nèi)制劑之一，其主要成分為山藥與蜂蠟，主要功效為生肌、斂瘡、散結(jié)、止痛，臨床多用于治療潰瘍性口腔炎、乳腺增生、卵巢囊腫等癥。臨床實踐顯示，在60例卵巢囊腫患者中，愈瘍膠囊治療的總有效率達到90%[4];藥效學與毒理學實驗表明，該藥能通過調(diào)節(jié)大鼠體內(nèi)激素分泌水平來改善乳腺增生，且長期用藥未見明顯毒性反應(yīng)[5]。根據(jù)我院臨床治療經(jīng)驗與筆者前期預實驗結(jié)果表明，愈瘍膠囊具有抗菌消炎等作用，但該制劑發(fā)揮上述作用的具體機制尚不明確。

Toll樣受體/核因子κB（TLR/NF-κB）通路是經(jīng)典的炎癥通路，細菌等病原微生物感染可導致該通路的激活，誘導炎癥因子的釋放，從而促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生，這也是創(chuàng)面皮膚傷口愈合緩慢的原因之一[6-7]。基于此，本文研究了愈瘍膠囊對細菌感染皮炎模型大鼠的抗炎作用及對TLR/NF-κB通路的影響，旨在為擴大愈瘍膠囊的臨床應(yīng)用、促進相關(guān)藥物研發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：SpectraMAX Plus384型酶標儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]、PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀（常州市中威電子儀器有限公司）、DHP-9012型電熱細菌培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）、BA400 Digital型數(shù)碼三目攝像顯微鏡（麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）、JEM-1400 PLUS型透射電子顯微鏡（日本JEOL公司）、優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)（成都超純科技有限公司）、DZKW-4型電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）、JY200C型電泳儀和JY-SCZ4+型垂直電泳槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）、5200型化學發(fā)光凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）、THZ-98A恒溫振蕩器（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

愈瘍膠囊[批號190901，川藥制字Z200800943，規(guī)格0.45 g/粒（1 g藥粉相當于原生藥1.5 g）]由涼山彝族自治州第二人民醫(yī)院制備，阿莫西林克拉維酸鉀（14 ∶ 1）干混懸劑[批號190315，規(guī)格600 mg（阿莫西林） ∶ 42.9 mg（克拉維酸）]購自上海海虹實業(yè)（集團）巢湖今辰藥業(yè)有限公司，大鼠白細胞介素1β（IL-1β）、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、羥脯氨酸（HYP）、膠原蛋白Ⅰ（Col Ⅰ）、Col Ⅲ酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號ZC- 36391、ZC-36404、ZC-36379、ZC-37624、ZC-37113、ZC- 36122、ZC-36009）均購自上海茁彩生物科技有限公司，兔TLR2單克隆抗體、兔TLR4多克隆抗體、兔磷酸化-NF-κB p65（p-NF-κB p65）多克隆抗體、生物素化山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗均購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，兔β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司，ECL發(fā)光試劑盒（批號KF001）購自安諾倫（北京）生物科技有限公司，5×十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液（批號AR1112-10）購自博士德生物工程有限公司;20×TBST緩沖液（批號28360）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司;MH肉湯購自廣州環(huán)凱微生物科技有限公司，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基購自杭州微生物試劑有限公司，蘇木精染液和伊紅染液均購自武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司;其余試劑均為分析純或?qū)嶒炇页Ｓ靡?guī)格，水為超純水。

1.3 動物

SPF級SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（230±20） g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（川）2020-030。

1.4 菌株

金黃色葡萄球菌購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

2 方法

2.1 菌懸液的制備

在凈化工作臺中，將金黃色葡萄球菌接種到牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18 h進行復蘇。取出復蘇后的細菌，挑選單個菌落至MH肉湯中，于37 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)12 h。取上述細菌適量，使用無菌生理鹽水制成1.5×108 CFU/mL的菌懸液，再用MH肉湯稀釋至1×106 CFU/mL，并于30 min內(nèi)完成后續(xù)接種。

2.2 受試藥液的制備

取愈瘍膠囊微粉10 g，溶于無菌生理鹽水100 mL中，制成質(zhì)量濃度為100 mg/mL的藥液，作為最大濃度;再用無菌生理鹽水倍比稀釋成50.00、25.00、12.50、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39 mg/mL的藥液，備用。

2.3 最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）的測定

參照文獻[8]采用肉湯稀釋法進行測定。取“2.2”項下各質(zhì)量濃度的受試藥液，按180 μL/孔加入至經(jīng)消毒處理過的96孔板中（每質(zhì)量濃度設(shè)置3個復孔），隨后按20 μL/孔加入“2.1”項下菌懸液。同時，設(shè)置陽性對照孔（只加入菌懸液20 μL）、陰性對照孔（只加入MH肉湯20 μL）、空白對照孔（只加入無菌生理鹽水20 μL），各設(shè)置3個復孔。將96孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后取出，以肉眼和顯微鏡觀察，并以顯微鏡下無明顯細菌生長的孔所對應(yīng)的藥液質(zhì)量濃度為MIC。取肉眼觀察無細菌生長的菌液各0.1 mL移種至不含藥物的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，以培養(yǎng)基中菌落計數(shù)少于5個的孔對應(yīng)的藥液質(zhì)量濃度作為MBC。

2.4 分組與造模

將50只大鼠隨機分成5組，即模型組、陽性對照組（阿莫西林克拉維酸鉀，以阿莫西林計120 mg/kg，按每日成人臨床常用劑量換算）和愈瘍膠囊高、中、低劑量組（以1倍MIC換算劑量作為中劑量，以2倍中劑量和1/2中劑量分別作為高、低劑量），每組10只。造模前24 h，用8%硫化鈉溶液脫去大鼠背部被毛;造模時，各組大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液（20 mL/kg）進行麻醉，將20 g砝碼燒紅，冷卻10 s后貼于大鼠背部，燙傷10 s，傷處涂抹金黃色葡萄球菌溶液（濃度為1×106 CFU/mL，溶劑為生理鹽水）1 mL，待其自然均勻分布，以患處出現(xiàn)大量黃、白色膿液，潰瘍，紅腫為細菌感染性皮炎模型復制成功標志。

2.5 藥物干預

造模成功24 h后，模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，各干預組大鼠灌胃對應(yīng)藥物（20 mL/kg），每日1次，連續(xù)7 d。末次給藥后，同“2.4”項下方法麻醉后，處死大鼠，收集傷處皮膚組織，部分組織于-80 ℃下保存，剩余組織在4%多聚甲醛-2%戊二醛固定液中固定，分別用于相關(guān)指標檢測、表征和形態(tài)學觀察。

2.6 大鼠皮膚組織表征觀察

觀察各組大鼠給藥第1、3、5、7 天時的一般體征和積膿、紅腫、潰瘍等表現(xiàn)，肉眼觀察傷口結(jié)痂、脫痂和愈合等情況，同時利用描繪創(chuàng)面的透明硫酸紙面積計算創(chuàng)面愈合率：創(chuàng)面愈合率（%）=（原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積。

2.7 大鼠皮膚組織中炎癥因子和纖維蛋白含量測定

取凍存的皮膚組織適量，按照ELISA試劑盒說明書操作，使用酶標儀于450 nm波長處測定光密度（OD）值并計算各組大鼠皮膚組織中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、HYP、Col Ⅰ、Col Ⅲ的含量。

2.8 大鼠皮膚組織形態(tài)學觀察

參考文獻[9]方法，取固定好的皮膚組織適量，經(jīng)包埋后切片，使用蘇木精-伊紅（HE）染料進行染色，在數(shù)碼三目攝像顯微鏡下觀察，評價各組大鼠皮膚組織形態(tài)學變化。病理評分標準：正常組織，無明顯損傷，記0分。表皮層鱗狀上皮層次僅局部超過2～3層，略有增厚;真皮層淺層有少量的炎細胞浸潤;可見少量壞死區(qū)域及肉芽組織，符合上述任一項者，記1分。表皮層鱗狀上皮層次明顯增厚;真皮層下均有中等量炎細胞浸潤;真皮層可見局灶壞死區(qū)域及肉芽組織，符合上述任一項者，記2分。表皮層鱗狀廣泛增厚并使黏膜凹凸不平;真皮層大量廣泛的炎細胞浸潤;真皮層可見大量壞死區(qū)域及肉芽組織，符合上述任一項者，記3分[9]。

2.9 大鼠皮膚組織超微結(jié)構(gòu)觀察

取固定好的皮膚組織適量，使用透射電子顯微鏡觀察各組大鼠成纖維細胞分布排列情況，膠原纖維分布排列情況、緊密程度，上皮細胞排列分布情況、結(jié)構(gòu)是否完好。

2.10 大鼠皮膚組織中TLR2、TLR4、p-NF-κB p65蛋白表達水平測定

采用Western blotting法進行測定。取凍存的皮膚組織適量，進行裂解、蛋白提取和定量。取蛋白樣本，與上樣緩沖液混合，煮沸10 min進行蛋白變性;取變性蛋白進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜、封閉，經(jīng)1×TBST漂洗1遍后，分別加入TLR2、TLR4、p-NF-κB p65一抗（稀釋比例均為1 ∶ 800）以及β-actin抗體（稀釋比例為1 ∶ 1 000），于4 ℃孵育過夜;加入生物素化山羊抗兔IgG二抗（稀釋比例為1 ∶ 5 000），在室溫下孵育2 h;經(jīng)1×TBST漂洗3遍后，以ECL顯色，運用化學發(fā)光凝膠成像儀成像，采用Image-Pro Plus 6.0圖像軟件進行分析，以β-actin作為內(nèi)參，將目標蛋白與內(nèi)參的灰度值比值作為目標蛋白的相對表達量，并以模型組為標準進行歸一化處理。上述試驗重復3次。

2.11 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 愈瘍膠囊對金黃色葡萄球菌的MIC與MBC

愈瘍膠囊對金黃色葡萄球菌的MIC為25 mg/mL，MBC為50 mg/mL;后續(xù)實驗中，愈瘍膠囊高、中、低劑量組給藥劑量分別設(shè)為600、300、150 mg/kg。

3.2 愈瘍膠囊對細菌感染皮炎模型大鼠皮膚組織表征的影響

與模型組比較，給藥第1、3、5、7 天時，陽性對照組和愈瘍膠囊高、中劑量組大鼠傷處皮膚組織紅腫、化膿情況較輕，傷口結(jié)痂程度高，愈合速度快，愈合率均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。其中，給藥3 d愈瘍膠囊高、中劑量組大鼠傷處皮膚部分出現(xiàn)結(jié)痂情況，紅腫消失;給藥5～7 d愈瘍膠囊高、中劑量組部分大鼠傷處出現(xiàn)脫痂。愈瘍膠囊低劑量組大鼠僅給藥第7天時愈合率顯著升高（P<0.05）。與愈瘍膠囊低劑量組比較，除愈瘍膠囊中劑量組大鼠給藥第1天的愈合率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）外，其余各時間點陽性對照組和愈瘍膠囊高、中劑量組大鼠的皮膚愈合率均顯著升高（P<0.01）。與陽性對照組比較，愈瘍膠囊高、中劑量組大鼠各時間點的皮膚愈合率差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），詳見表1。

3.3 愈瘍膠囊對細菌感染皮炎模型大鼠皮膚組織中炎癥因子含量的影響

與模型組比較，陽性對照組和愈瘍膠囊高、中、低劑量組大鼠皮膚組織中IL-10、TNF-α含量，陽性對照組與愈瘍膠囊高、中劑量組大鼠皮膚組織中IL-1β含量以及陽性對照組與愈瘍膠囊高劑量組大鼠皮膚組織中IL-6含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與愈瘍膠囊低劑量組比較，陽性對照組大鼠皮膚組織中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α含量以及愈瘍膠囊高劑量組大鼠皮膚組織中IL-1β、TNF-α含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與陽性對照組比較，愈瘍膠囊高、中劑量組大鼠皮膚組織中上述4個炎癥因子含量差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），詳見表2。

3.4 愈瘍膠囊對細菌感染皮炎模型大鼠皮膚組織中纖維蛋白含量的影響

與模型組比較，陽性對照組和愈瘍膠囊高劑量組大鼠皮膚組織中HYP、Col Ⅰ、Col Ⅲ含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與愈瘍膠囊低劑量組比較，陽性對照組大鼠皮膚組織中HYP、Col Ⅰ、Col Ⅲ含量以及愈瘍膠囊高劑量組大鼠皮膚組織中HYP含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與陽性對照組比較，愈瘍膠囊高、中劑量組大鼠皮膚組織中上述3個纖維蛋白含量差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），詳見表3。

3.5 愈瘍膠囊對細菌感染皮炎模型大鼠皮膚組織形態(tài)學變化的影響

與模型組比較，陽性對照組和愈瘍膠囊高劑量組大鼠皮膚組織中可見較多纖維組織增生及少量炎細胞浸潤，主要以核呈卵圓形或長橢圓形的成纖維細胞增生為主，少量核呈長梭形，胞質(zhì)較少，間質(zhì)可見少量中性粒細胞和淋巴細胞等炎細胞浸潤，未見其他明顯病變;愈瘍膠囊中、低劑量組大鼠皮膚組織均出現(xiàn)部分區(qū)域損傷，真皮內(nèi)層可見炎細胞浸潤，主要以中性粒細胞和淋巴細胞為主，個別損傷處表皮明顯增厚，少量成纖維細胞增生，其中低劑量組大鼠炎細胞浸潤更嚴重，詳見圖1（圖中， 為成纖維細胞， 為細胞碎片，為炎細胞）。

與模型組比較，陽性對照組和愈瘍膠囊高、中劑量組大鼠的病理評分均顯著降低（P<0.01）。與愈瘍膠囊低劑量組比較，陽性對照組和愈瘍膠囊高、中劑量組大鼠病理評分均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與陽性對照組比較，愈瘍膠囊高、中劑量組大鼠皮膚組織病理評分差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），詳見表4。

3.6 愈瘍膠囊對細菌感染皮炎模型大鼠皮膚組織超微結(jié)構(gòu)的影響

模型組大鼠皮膚組織中成纖維細胞生成少，排列紊亂，大部分細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量少，細胞結(jié)構(gòu)模糊，胞核變形甚至溶解消失;陽性對照組大鼠皮膚組織中成纖維細胞生成較多，排列整齊，且核多呈長梭形，細胞內(nèi)微絲較多;愈瘍膠囊高、中劑量組大鼠皮膚組織中成纖維細胞生成較多，結(jié)構(gòu)較完整，細胞邊緣可見微絲;愈瘍膠囊低劑量組大鼠皮膚組織中可見纖維細胞增生，數(shù)量較少，細胞結(jié)構(gòu)不明顯，排列紊亂，詳見圖2。

3.7 愈瘍膠囊對細菌感染皮炎模型大鼠皮膚組織中TLR2、TLR4、p-NF-κB p65蛋白表達水平的影響

與模型組比較，陽性對照組和愈瘍膠囊高、中、低劑量組大鼠皮膚組織中TLR2、TLR4、p-NF-κB p65蛋白的表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與愈瘍膠囊低劑量組比較，陽性對照組和愈瘍膠囊高、中劑量組大鼠皮膚組織中TLR2、TLR4（除愈瘍膠囊中劑量組外）、p-NF-κB p65蛋白的表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與陽性對照組比較，愈瘍膠囊高劑量組大鼠皮膚組織中上述3個蛋白的表達水平差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），愈瘍膠囊中劑量組大鼠皮膚組織中上述3個蛋白的表達水平均顯著升高（P<0.05），詳見圖3、表5。

4 討論

皮膚損傷愈合的過程可分為4個階段，即止血階段、炎癥階段、增殖階段和重塑階段[10]。損傷皮膚組織在血管收縮和止血后立即在傷口處產(chǎn)生炎細胞以消除病原體和細胞碎片，隨后通過角質(zhì)形成細胞、成纖維細胞向傷口的遷移以及血管生成來實現(xiàn)肉芽組織的增殖[11]。近年來，抗生素是細菌性感染疾病的治療首選，但抗生素的毒副作用相當大，嚴重者可造成患者耳聾等[12];同時，若長期使用抗生素，易造成患者體內(nèi)菌群失調(diào)，誘導多重耐藥的條件致病菌、真菌的二重感染，增加治療難度[13]。具有抑菌作用的中藥復方或單方制劑因其不良反應(yīng)相對較輕且不易產(chǎn)生耐藥等優(yōu)點逐漸受到學者的關(guān)注。已有研究表明，中藥及其提取物（人參、桂皮、丹參等）可通過刺激血管生成和膠原合成而作為創(chuàng)傷修復的治療劑[14]。因此，開發(fā)有效抑菌的中藥已成為相關(guān)研究的熱點之一。

金黃色葡萄球菌是人類皮膚感染中最常見的病原體，也是院內(nèi)傷口感染的主要原因[15]。金黃色葡萄球菌可分泌毒力因子和毒素，以幫助病原體逃避宿主的免疫系統(tǒng)，導致重復慢性感染、長期炎癥和感染傷口延遲愈合[16]。為了確定愈瘍膠囊的抑菌能力，本研究選用金黃色葡萄球菌為研究對象，首先測定了該藥的體外抑菌能力，用于確定其體內(nèi)實驗劑量。結(jié)果，愈瘍膠囊對金黃色葡萄球菌的MIC為25 mg/mL，MBC為50 mg/mL;由MIC最終確定體內(nèi)實驗的高、中、低劑量分別為600、300、150 mg/kg。

評價皮膚感染與損傷程度的一個重要指標就是觀察傷處皮膚表征，根據(jù)其是否出現(xiàn)紅腫、化膿、潰瘍等癥狀評價模型是否復制成功，并以此評價藥物的作用效果。在本研究中筆者發(fā)現(xiàn)，給藥第1、3、5、7天時，愈瘍膠囊高、中劑量組大鼠皮膚愈合率均顯著高于模型組，愈瘍膠囊低劑量組大鼠僅在給藥第7天時的皮膚愈合率顯著高于模型組，愈瘍膠囊高劑量組大鼠給藥第1、3、7天時的皮膚愈合率有高于陽性對照組的趨勢。

皮膚組織中細胞的生成情況與細胞結(jié)構(gòu)的變化可以直觀地反應(yīng)皮膚愈合的程度，使用透射電鏡可以清楚地觀察細胞類型與細胞結(jié)構(gòu)。HE染色結(jié)果顯示，模型組大鼠真皮及皮下組織均有不同程度壞死、出血，纖維組織增生，炎細胞浸潤等系列病理改變，而陽性對照組和愈瘍膠囊高劑量組大鼠病變程度明顯好轉(zhuǎn)，中、低劑量組大鼠病變好轉(zhuǎn)程度不及陽性對照組和高劑量組。經(jīng)過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠大部分上皮細胞與纖維細胞的結(jié)構(gòu)被破壞，而新生的纖維細胞非常少，且排列紊亂，這跟細菌感染有密切關(guān)聯(lián)[17]。在使用愈瘍膠囊7 d后，損傷的纖維細胞明顯得到修復，壞死的細胞得到補充，上皮細胞開始形成并分化，構(gòu)成基本的皮膚組織。這說明愈瘍膠囊能誘導成纖維細胞與上皮細胞的形成，加快皮膚組織修復的速度。

損傷的皮膚容易被金黃色葡萄球菌入侵，造成化膿性感染，通過病原相關(guān)的分子模式和毒素激活多重促炎信號級聯(lián)，在局部和全身都引發(fā)強烈的炎癥反應(yīng)[18]。據(jù)報道，角質(zhì)形成細胞可產(chǎn)生促炎細胞因子，包括IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等[19]。IL-1β是一個強有力的炎性細胞因子，當細胞損傷時，被炎性小體激活，從宿主細胞中被釋放出來，幫助調(diào)節(jié)各種免疫反應(yīng)[20-21]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，陽性對照組與愈瘍膠囊高、中劑量組大鼠皮膚組織中IL-1β含量顯著降低，提示感染程度減輕，皮膚愈合加快[22]。與此同時，皮膚屏障被破壞后，細胞中IL-6、IL-10、TNF-α均可促進傷口的炎癥反應(yīng)[23]。本研究中發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，陽性對照組大鼠皮膚組織中IL-6、IL-10、TNF-α含量和愈瘍膠囊高劑量組大鼠皮膚組織中TNF-α含量均顯著降低，提示愈瘍膠囊能減輕因感染引起的炎癥反應(yīng)。

在皮膚愈合的過程中，細胞外基質(zhì)的重建十分重要，而在這個階段，成纖維蛋白與膠原纖維含量的多少會對皮膚的修復起到關(guān)鍵作用[24]。HYP主要存在于皮膚、結(jié)締組織等地方，可反映膠原蛋白的含量[25]。ColⅠ和ColⅢ均是構(gòu)成皮膚組織的主要膠原成分，可協(xié)助創(chuàng)面修復，促進皮膚愈合[26]。本研究中發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，陽性對照組和愈瘍膠囊高劑量組大鼠HYP、ColⅠ和ColⅢ含量均顯著升高，提示愈瘍膠囊能加快大鼠皮膚修復。

感染性皮炎所涉及的炎癥通路非常復雜，其中TLR/NF-κB就是一條經(jīng)典通路[6-7]。TLR2是金黃色葡萄球菌細胞壁成分的信號受體，同時還可作為其他常見細菌結(jié)構(gòu)模式的信號受體[23]。TLR4主要存在于淋巴組織中，由單核細胞和巨噬細胞以及T、B淋巴細胞表達[27]。TLR家族可激活NF-κB過度釋放促炎細胞因子，引發(fā)炎癥。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，陽性對照組和愈瘍膠囊高、中、低劑量組大鼠皮膚組織中TLR2、TLR4、p-NF-κB p65蛋白表達水平均顯著降低，提示愈瘍膠囊能抑制TLR/NF-κB炎癥通路，使皮膚感染過程中炎癥因子的釋放減少，促進皮膚愈合。

阿莫西林克拉維酸鉀是一種常用的口服廣譜抗菌藥，但是也存在明顯的缺點，長期使用廣譜抗菌藥會是細菌耐藥概率增加[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，600 mg/kg的愈瘍膠囊和120 mg/kg的阿莫西林能在大鼠體內(nèi)產(chǎn)生相當?shù)目寡仔Ч瑢δz原蛋白的生成與細胞修復效果均無明顯差異，而300 mg/kg愈瘍膠囊雖然也有抗炎效果，但效果不及阿莫西林。此外，在劑量高于阿莫西林克拉維酸鉀5倍的情況下，600 mg/kg的愈瘍膠囊也未導致大鼠出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)，進一步說明愈瘍膠囊的毒性較低，但其具體作用機制還需后期進一步研究。

綜上所述，愈瘍膠囊可促進細菌感染皮炎模型大鼠皮膚愈合，具有一定的抗炎作用，其機制可能與抑制TLR/NF-κB信號通路、減少炎癥反應(yīng)有關(guān)。

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（收稿日期：2020-11-05 修回日期：2021-01-08）

（編輯：鄒麗娟）