坎地沙坦靶向TRAIL-DR5介導的AMPK信號通路減少宮頸癌細胞自噬保護的研究

齊廣濤，張麗麗，郭慶枝，王 莉，李 麗

近幾年宮頸癌發病率居高不下，并呈年輕化趨勢，患者復發率高，預后不佳。自噬與癌癥進展相關，能誘導細胞凋亡，也能實現細胞器更新和代謝需求，進而保護細胞。腺苷酸活化蛋白激酶(adenosinemonophosphateactivatedproteinkinase，AMPK)激活可調節細胞增殖、凋亡、氧化應激，是細胞自噬途徑的上游通路。腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體-死亡受體5(tumornecrosisfactor-relatedapoptosisinducingligand-deathreceptor5，TRAIL-DR5)是與自噬相關的跨膜受體，能上調DR5水平進而促進癌細胞凋亡。坎地沙坦是血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)受體拮抗劑，臨床常用于降血壓、改善心肌重塑，在腫瘤增殖、侵襲、血管生成方面也發揮重要作用，可抑制宮頸癌HeLa細胞增殖，但作用機制未知。該研究測定經坎地沙坦作用后的HeLa細胞中自噬相關因子水平，以探究坎地沙坦調控HeLa細胞自噬保護作用相關機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

坎地沙坦購自上海阿拉丁試劑有限公司，貨號：C129234-1 g；兔抗人TRAIL-DR5、兔抗人AMPK、兔抗人AMPK磷酸化(p-AMPK)、兔抗人自噬相關基因4A(autophagy related gene4A，ATG4A)、兔抗人微管相關蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3，LC3)、兔抗人Bax、兔抗人Bcl-2、兔抗人β-actin、兔抗人p62一抗均購自上海熹垣生物科技有限公司，貨號分別為：XY-R30939、XY-70R-35353、XY-70R-7162、XY-SPC-626D-STR、XY-70R-21593、XY-70R-33866、XY-PSC-70-567-R050、XY-CVL-PAB72987、XY-F48757；羊抗兔IgG-HRP二抗購自上海恒斐生物科技有限公司，貨號：SE134；Annexin V-FITC/PI試劑盒購自上海科敏生物科技有限公司，貨號：KA3805；iBright FL1500智能成像系統、Attune NxT流式細胞儀購自美國賽飛世爾科技公司。

1.2 細胞

人宮頸癌細胞株HeLa購自中科院上海細胞庫。5%CO、37 ℃、98%相對濕度的恒溫培養箱中培養，培養液為含有10%FBS的DMEM培養基。隔天換液，0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數生長期細胞用于實驗。

1.3 CCK-8法測定坎地沙坦對HeLa細胞增殖的抑制作用

收集對數生長期HeLa細胞，用DMEM培養基調整細胞密度，HeLa細胞按照8×10個/孔的數量接種至96孔板中。繼續常規培養過夜，棄去舊DMEM培養基，加入200 μl含有不同濃度坎地沙坦(坎地沙坦終濃度分別為2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μmol/L)的DMEM培養基，培養48 h后，棄去舊DMEM培養基，各孔加入20 μl CCK-8溶液和不含FBS的180 μl DMEM培養基，2 h后棄培養基，用酶標儀測定450 nm波長處吸光度(optical density, OD)值，同時設置0.1%的DMSO對照組和空白對照組，每個濃度設置6個復孔。細胞增殖抑制率(%)=[1-(OD-OD)/(OD-OD)]×100%。用SPSS軟件計算坎地沙坦對HeLa細胞的半數抑制濃度(IC)。

1.4 流式細胞儀測定坎地沙坦對HeLa細胞凋亡率的影響

收集對數生長期HeLa細胞，用DMEM培養基調整細胞密度，HeLa細胞按照2.0×10個/孔的數量接種至6孔板中，繼續培養過夜，棄去舊培養液，加入含有0.0、15.0、30.0、60.0 μmol/L坎地沙坦的DMEM培養基，培養48 h后，棄去舊DMEM培養基，避光條件下用FITC和PI標記，具體操作按照試劑盒說明書進行，每個濃度設置6個復孔，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 透射電鏡觀察坎地沙坦處理后HeLa細胞中自噬體

HeLa細胞經0.0、15.0、30.0、60.0 μmol/L坎地沙坦處理48 h后，胰酶消化，用預冷的PBS重懸HeLa細胞，離心、棄上清液，用2.5%戊二醛固定，脫水、包埋、切片，枸櫞酸鉛染色，透射電鏡觀察HeLa細胞中自噬體數。

1.6 免疫熒光檢測坎地沙坦處理后HeLa細胞中p62蛋白表達

HeLa細胞以2.0×10個/孔接種至含有細胞爬片的24孔板中，培養過夜，棄舊培養基，加入有0.0、15.0、30.0、60.0 μmol/L坎地沙坦的DMEM培養基，培養48 h后，棄去舊DMEM培養基，PBS清洗3次，用4%多聚甲醛固定15 min，PBS清洗3次，通透、封閉，加入兔抗人p62一抗孵育過夜，避光下加入熒光二抗，37 ℃暗室孵育3 h，滴加DAPI，37 ℃暗室孵育5 min，PBS清洗3次，濾紙吸干，封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.7 Western blot測定坎地沙坦處理后HeLa細胞中TRAIL-DR5、AMPK、ATG4A、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Bax、Bcl-2蛋白水平

用RIPA液裂解不同濃度坎地沙坦處理后的HeLa細胞，4 ℃離心提取總蛋白，根據BCA試劑盒說明書測定總蛋白含量。SDS-PAGE電泳分離目標蛋白(80 V，30 min；120 V，60 min)，轉至PVDF膜上，5% BSA封閉，分別加入相應兔抗人一抗(1 ∶1 000)，孵育過夜，加入羊抗兔IgG/HRP，孵育2 h，ECL顯色，測定條帶灰度值，蛋白相對含量=目標蛋白灰度值/內參蛋白灰度值。

2 結果

2.1 坎地沙坦對HeLa細胞增殖抑制的影響

0.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μmol/L坎地沙坦作用于HeLa細胞48 h后，增殖抑制率分別為(0.59±0.21)%、(9.54±1.06)%、(16.44±1.75)%、(30.58±4.01)%、(45.80±5.36)%、(67.33±6.17)%和(86.29±8.94)%，增殖抑制率隨濃度增加而升高，具有濃度依賴性。坎地沙坦對HeLa細胞的IC為(32.38±3.46)μmol/L，參照IC值，后續實驗采用0.0、15.0、30.0、60.0 μmol/L坎地沙坦進行。見表1。

表1 HeLa細胞中ATG4A、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Bax、Bcl-2蛋白水平比較

2.2 坎地沙坦對HeLa細胞凋亡的影響

0.0、15.0、30.0、60 μmol/L坎地沙坦作用于HeLa細胞48 h后，細胞凋亡率分別為(1.26±0.13)%、(4.90±0.58)%、(7.18±1.05)%和(17.86±2.05)%。與0.0 μmol/L坎地沙坦相比，15.0、30.0、60.0 μmol/L坎地沙坦處理后，HeLa細胞凋亡率升高(

P

<0.05)，且呈濃度依賴性(

P

<0.05)。見圖1、表2。

圖1 不同濃度坎地沙坦對HeLa細胞凋亡率的影響A:0.0 μmol/L坎地沙坦組； B:15.0 μmol/L坎地沙坦組；C:30.0 μmol/L坎地沙坦組；D:60.0 μmol/L坎地沙坦組

2.3 坎地沙坦對HeLa細胞中自噬體數目的影響

0.0 μmol/L坎地沙坦處理后，可見HeLa細胞中自噬體數目較多，經15.0、30.0、60.0 μmol/L坎地沙坦處理后，HeLa細胞中自噬體數目減少。見圖2。

圖2 坎地沙坦處理后HeLa細胞中自噬體數目比較 ×20 000

2.4 坎地沙坦對p62蛋白表達的影響

0.0 μmol/L坎地沙坦理后，可見HeLa細胞中p62蛋白熒光較弱，經15.0、30.0、60.0 μmol/L坎地沙坦處理后，HeLa細胞中p62蛋白熒光強度增強，呈濃度依賴性。見圖3。

圖3 免疫熒光檢測p62蛋白表達 ×200

2.5 坎地沙坦處理后HeLa細胞中ATG4A、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Bax、Bcl-2蛋白水平

與0.0 μmol/L坎地沙坦相比，經15.0、30.0、60.0 μmol/L坎地沙坦處理后，HeLa細胞中Bax蛋白水平升高(

P

<0.05)，Bcl-2、ATG4A、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平降低(

P

<0.05)。見表1和圖4。

圖4 Western blot檢測HeLa細胞中ATG4A、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Bax、Bcl-2蛋白水平A:0.0 μmol/L坎地沙坦組； B:15.0 μmol/L坎地沙坦組；C:30.0 μmol/L坎地沙坦組；D:60.0 μmol/L坎地沙坦組

2.6 坎地沙坦處理后HeLa細胞中TRAIL-DR5、p-AMPK水平比較

與0.0 μmol/L坎地沙坦相比，經15.0、30.0、60.0 μmol/L坎地沙坦處理后，HeLa細胞中TRAIL-DR5水平升高(

P

<0.05)，p-AMPK水平降低(

P

<0.05)。見表2和圖5。

圖5 Western blot檢測HeLa細胞中TRAIL-DR5、AMPK、p-AMPK水平A:0.0 μmol/L坎地沙坦組； B:15.0 μmol/L坎地沙坦組；C:30.0 μmol/L坎地沙坦組；D:60.0 μmol/L坎地沙坦組

表2 HeLa細胞中TRAIL-DR5、p-AMPK水平比較

3 討論

近幾年，宮頸癌的病死率和發病率居高不下，每年新增患者近50萬例，主要由人乳頭瘤病毒感染誘發，但具體發病機制尚未有統一定論。自噬因在腫瘤發生發展中具有雙重作用而備受關注，可能成為腫瘤治療中促進腫瘤細胞凋亡的靶點。

坎地沙坦因具有降壓作用被廣泛應用于臨床，后因抗癌作用而成為研究熱點，但是其作用機制仍在探究。研究表明坎地沙坦可抑制AngⅡ誘導的肝癌HepG2細胞增殖。本研究顯示，HeLa細胞增殖抑制率隨坎地沙坦處理濃度的增加而升高，說明坎地沙坦具有抑制HeLa細胞增殖的作用。Bax、Bcl-2分別為促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白，在凋亡進程中發揮重要作用。本研究表明，坎地沙坦處理后，HeLa細胞中Bcl-2蛋白水平降低，凋亡率及Bax蛋白水平升高，同樣說明坎地沙坦可促進HeLa細胞凋亡，有望成為治療宮頸癌的候選藥物。韓燕燕研究表明，坎地沙坦可以阻斷AngⅡ對HeLa細胞分泌VEGF的促進作用，從而影響HeLa細胞的轉移侵襲作用，本研究將從其他途徑進一步研究其作用機制。

自噬與細胞增殖密切相關，研究表明自噬抑制劑羥氯喹(HCQ)可減少骨髓瘤細胞中自噬泡數量，誘導細胞凋亡。后續研究顯示，三結構域蛋白21(TRIM21)在肝癌組織中低表達，上調其水平，可下調肝癌細胞中自噬相關蛋白ATG4B水平。ATG4A是調控自噬的關鍵蛋白，可通過促進自噬促進腫瘤轉移。LC3分為I型和II型，自噬發生過程中，I型經加工后轉化為II型，其中LC3II與自噬體數量呈正向關。P62在自噬發生時可結合LC3-Ⅱ蛋白形成復合物，最終在溶酶體中降解。本研究顯示，經坎地沙坦處理后，HeLa細胞中p62蛋白熒光強度較強，自噬體數減少，ATG4A、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平降低，說明坎地沙坦可抑制HeLa細胞發生自噬，進而促進細胞凋亡。TRAIL與DR5結合，進一步與半胱天冬酶-8(caspase-8)締合，誘導caspase-9活化，隨后活化caspase-3導致腫瘤細胞凋亡。研究表明，坎地沙坦可靶向上調TRAIL-DR5水平，從而提高TRAIL介導的人肺腺癌細胞凋亡的敏感性。本研究同樣顯示，經坎地沙坦處理后，TRAIL-DR5水平升高，說明坎地沙坦可能通過上調TRAIL-DR5水平，抑制自噬，從而促進HeLa細胞凋亡。AMPK在細胞水平上調節能量平衡，激活后可誘導自噬，抑制癌細胞凋亡。此外，研究表明坎地沙坦可下調AMPK磷酸化水平，抑制自噬。本研究顯示，坎地沙坦處理后，HeLa細胞中TRAIL-DR5水平升高，p-AMPK水平降低，說明坎地沙坦可能上調TRAIL-DR5水平從而抑制AMPK磷酸化，進而抑制自噬，促進細胞凋亡。