信號素3F及其受體神經纖毛蛋白在腫瘤微環境中的研究進展

楚師成，高學軍，宋云浩，吳天宇

作者單位：濱州醫學院煙臺附屬醫院胸外科，山東 煙臺264000

腫瘤被認為是孤立的細胞團塊，獨立存在于器官特定部位的時代早已一去不復返了。目前的觀點認為，腫瘤與細胞外基質、血管、結締組織和免疫細胞在其周圍環境中的相互作用構成腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）促進腫瘤的生長、侵襲和轉移。腫瘤細胞的免疫逃避、生理耐受以及局部和全身的侵襲性由其所處的腫瘤微環境決定，不同的微環境造就了不同的腫瘤特性。信號素（semaphorins，SEMA）是腫瘤微環境的重要調節因子，在癌癥中的調節作用不容忽視。一方面，腫瘤的進展和轉移擴散取決于癌細胞的固有屬性，如存活、自我更新以及遷移和侵襲性的能力。另一方面，腫瘤間質包括內皮細胞、成纖維細胞和免疫系統細胞與癌細胞進行活躍的分子串擾。在腫瘤血管中過度表達的神經纖毛蛋白（neuropilin，NRP）會導致腫瘤播散及其他不良結果。本研究對腫瘤微環境中信號素3F（semaphorins 3F，SEMA3F）及其受體NRP在腫瘤微環境中的作用進行綜述。

1 SEMA

SEMA 是一類分泌型、跨膜型和糖磷脂酰肌醇連接的糖蛋白，在脊椎動物中，信號素家族的20 多個成員已經被識別出來，并根據結構特性被劃分為5 個類別（SEMA 3-7）；第3 類信號素為分泌蛋白，第4-6類信號素為跨膜蛋白，第7類信號素為膜相關蛋白。信號素最初被描述具有軸突導向分子的功能，在神經元發育過程中起調節神經元網絡作用，但現在已經認識到，它還具有非神經元特性，包括血管生成、炎癥和腫瘤發展。

近年來，信號素被發現參與到血管和腫瘤生物學中，它可以弱化體外內皮細胞遷移和腫瘤細胞外侵，也可以抑制體內腫瘤的進展、轉移和血管生成。其中3 類信號肽可以抑制腫瘤細胞和對腫瘤進展起關鍵作用的基質細胞類型，如血管內皮細胞；也可以利用NRP 和叢狀蛋白（Plexin）誘導肌動蛋白細胞骨架坍塌，最終達到抑制腫瘤細胞和內皮細胞遷移和運動的目的。然而，也有一些3 類信號素，如SEMA3C 和SEMA3E，具有雙重活性，由于具有激活Plexin-B1 受體的能力和被切割的SEMA3E 激活ErbB2（表皮生長因子受體2）等特性而同時具有誘導和抑制腫瘤進展的作用。

SEMA3F 被認為是一種潛在的腫瘤抑制因子，其主要作用在于抑制多種癌細胞的生長、侵襲和轉移。首先，它可以直接抑制腫瘤細胞的存活、黏附、運動和侵襲，如在乳腺癌中，癌細胞的附著和片狀脂質的延伸可以被SEMA3F 抑制。其次，它在體外和體內的高轉移腫瘤細胞中的表達持續下調。同時表達SEMA3F 的腫瘤細胞在體外抑制細胞黏附、遷移以及體內腫瘤血管生成和轉移，如過度表達SEMA3F 的黑色素瘤細胞在體外遷移減少，并導致體內良性腫瘤表型。最后，SEMA3F 可以抑制血管生成過程中的細胞黏附、遷移和微血管萌發等步驟從而對血管內皮細胞產生直接影響。利用SEMA3F 對激活整合素以及對血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和堿性成纖維細胞生長因子的抑制來減少腫瘤血管的生成。表達SEMA3F的腫瘤細胞可以產生類似于信號素誘導的軸突排斥反應來排斥淋巴內皮細胞。作為腫瘤抑制基因，SEMA3F 映射到人類染色體3p21.3 上的一個區域，該區域雜合性的丟失已被證實與肺癌的發生相關。在肺癌中，SEMA3F 的過度表達與致瘤性降低相關。在纖維肉瘤細胞系中，SEMA3F 已被證明會導致其完全喪失致瘤性。良性腫瘤細胞表達SEMA3F，而高轉移的腫瘤細胞不表達SEMA3F，這表明轉移潛能和SEMA3F 表達之間存在反向關系。

作為腫瘤微環境中的重要組成成分，SEMA3F對腫瘤細胞和周圍的非腫瘤細胞包括巨噬細胞、成纖維細胞和內皮細胞等有多方面的影響。SEMA3F是一種分泌性生理mTOR（哺乳動物雷帕霉素靶體蛋白）抑制劑，通過磷脂酰肌醇3 激酶-蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶體蛋白（PI-3K-Akt/mTOR）信號通路來抑制腫瘤生長、血管生成和轉移（圖1）。SEMA3F 也可與血管內皮生長因子-C（vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C）競爭性結合神經纖毛蛋白-2（neuropilin-2，NRP2）從而抑制淋巴管生成。SEMA3F 體外抑制VEGF 誘導的轉錄與翻譯以及體內的強大的抗腫瘤作用使其成為腫瘤微環境調節劑成為可能。

圖1 信號素3F-神經纖毛蛋白2/叢蛋白相互作用介導的調控信號通路示意圖[5］

2 NRP

1987年，在非洲爪蟾蜍中Takagi 等通過免疫熒光法在其神經組織的冷凍切片中發現了一種跨膜糖蛋白家族的多功能非酪氨酸激酶受體-NRP。它 包 括神經纖毛蛋白-1（neuropilin-1，NRP1）和NRP2 兩個亞型。NRP1 和NRP2 兩個基因，結構域和功能域同源性約有50%。細胞外結構域分為三個子結構域，2個CUB結構域同源性區域（a1和a2）、2 個凝固因子Ⅴ/Ⅷ同源性區域（b1 和b2），它們是配體結合域；1 個含有MAM 結構域的C 區域，這些區域是二聚反應的關鍵。各種脈管細胞及神經組織之所以在萌發及生長過程中表現為不同的生物學特性，就是得益于不同亞型的NRP 蛋白上的不同位點具有辨別SEMA或VEGF的能力。

NRP1 和NRP2 都是胚胎血管發育必不可少的早期基因。但NRP 自身不能啟動信號通路，需要與神經叢蛋白或血管內皮生長因子受體（VEGF receptors，VEGFRs）等受體相互作用才能發揮生物學效應。血管內皮細胞膜的表層的NRP1 通過與VEGF 及其受體形成NRP1/VEGF/血管內皮生長因子受體2（VEGF receptors 2，VEGFR2）復合體來促進血管生成及腫瘤的發生。NRP1 還可與VEGF 及其受體外的（如血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）和血小板衍生生長因子受體（platelet-derived growth factor receptor ，PDGFR））其他生長因子結合，對細胞增殖及血管生成形成重要影響。此外，NRP1 可以通過不依賴于VEGF-VEGFR2 途徑的Abelson 酪氨酸激酶（Abelson tyrosine kinase，ABL）途徑促進血管生成。還有，腫瘤生長可在纖維連接蛋白與NRP1 結合后激活ABL 得到促進。腫瘤治療中單獨抑制VEGF-VEGFR2 通路的局限性在抑制NRP1 后得到克服，這為腫瘤的靶向治療提供新思路。

NRP2 可 與VEGF-A165、VEGF-A145、VEGF-C和PLGF（胎盤生長因子）結合并在淋巴管內皮細胞膜的表層表達，正常淋巴管與腫瘤間質淋巴管的萌發生長和淋巴道轉移被其所調控。研究表明，在VEGF-C 介導的VEGFR3 信號通路和發育性淋巴管生成中NRP2 扮演了重要角色。此外白血病、黑色素瘤和神經母細胞瘤等非上皮性腫瘤中也檢測到了NRP2 的存在。已成為潛在的免疫治療靶點的腫瘤相關巨噬細胞（Tumor-associated macrophages，TAM）以免疫沉默的方式吞噬腫瘤微環境（Tumor microenvironment，TME）中凋亡的腫瘤細胞，維持免疫抑制的微環境，從而達到對腫瘤的發生和抗腫瘤免疫反應的調節。NRP2 可以在巨噬細胞的分化過程中被腫瘤細胞誘導表達，其也可以影響巨噬細胞的吞噬功能。以CD8T 和NK 細胞浸潤為特征的抗腫瘤免疫反應在因TAM中NRP2缺失導致腫瘤細胞清除障礙、腫瘤內繼發性壞死增加以及免疫耐受破壞的情況下被重新啟動。這提示胞吐與免疫抑制之間可能由NRP2 作為介質形成連接。此外，在骨肉瘤和結直腸癌中，腫瘤轉移及預后與NRP2的表達程度密切相關，并且通過短發夾RNA 沉默NRP2的表達減少了腫瘤的發展。

3 SEMA3F-NRP復合物

NRP 作為SEMA 的關鍵受體之一，最經典的作用是作為3類分泌型SEMAs的結合蛋白。除了與Plexin-D1 直接結合的SEMA3E 之外，3 類SEMAs 需要NRP 作為輔助受體來介導信號傳遞。NRP 受體具有非常短的胞內域，在某些情況下不需要這些結構域來傳遞SEMA 信號，但是NRP 與各種信號轉導受體（包括叢蛋白和細胞黏附分子）一起工作，并且可以作用于穩定SEMA/受體之間的相互作用。NRP1 和NRP2 可以結合SEMA3B 和SEMA3C，而通常認為NRP2 只對SEMA3F 和SEMA3G 具有較高的結合親和力。但Nasarre 等發現SEMA3F 可能能夠使用NRP1 轉導信號，對于表達NRP1 但不表達NRP2 的乳腺癌MDA-MB-231 細胞，SEMA3F 可成功抑制其腫瘤形成，SEMA3F 對其應無抑制作用，但在其細胞中NRP1 的含量高，因此認為NRP1 是SEMA3F 形成對腫瘤細胞抑制作用的媒介，而且使SEMA3F 得到了高表達。同時SEMA3F 對這類細胞衍生腫瘤的抗血管新生作用的抑制增強了這種效果。但在MCF-7 細胞中，其僅表達SEMA3F 及NRP1，因此在含有MCF-7 的腫瘤中，SEMA3F 缺乏抗腫瘤作用，由于含有MCF-7 的腫瘤細胞中NRP1 受體濃度較低以及NRP2 表達下調，導致SEMA3F 誘導抗血管生成作用降低，減弱了其抗腫瘤的作用。因此在不同的細胞中，SEMA3F對NRP的結合力不同，不可把SEMA3F認為是純NRP2的結合劑。

信號素控制腫瘤細胞行為信號素作為多功能信號，能夠控制腫瘤細胞的多種功能，從生存、增殖和凋亡到細胞黏附和遷移。信號素可能是由腫瘤微環境中的細胞（如浸潤的白細胞）釋放的，也可能是由癌細胞釋放的，癌細胞可以建立自己的自分泌調節環。細胞存活、增殖和凋亡共同決定癌癥進展的細胞行為的基本變化包括生長信號的自給自足、無限的復制潛力和避免凋亡。SEMA3F作為NRP的一種特定配體，它與NRP2 的相互作用在體外可抑制血管內皮生長因子的表達，降低mTOR 誘導的細胞活化反應以及使穩定的細胞骨架遭到破壞。存在于異種移植物中表達NRP2 的腫瘤會被體內局部和全身超量生成的SEMA3F 抑制其生長。SEMA3F 通過抑制VEGF 的產生和分泌，阻斷VEGFNRP 結合，從而抑制腫瘤細胞的生成特性。已經有多個研究小組證明SEMA3F可以抑制多種腫瘤的腫瘤生長、淋巴生成和轉移，如黑色素瘤、骨肉瘤、卵巢癌、結腸癌和肺癌。這些腫瘤的VEGF-C 表達、T分期、淋巴結轉移、淋巴管浸潤、淋巴管密度與NRP2 的表達呈正相關。而SEMA3F 的低表達與分化差、淋巴結轉移率高顯著相關。表達高水平VEGF-C 或NRP2，或低水平SEMA3F 的患者復發風險更高，總生存期更短。如在肺癌中Zeb-1（E-box轉錄抑制因子）直接結合SEMA3F基因的啟動子，抑制SEMA3F 轉錄。SEMA3F 通常被認為是一種腫瘤抑制基因，在實體瘤中它的表達表現為下調，但它在白血病和淋巴瘤中的功能可能不同，有待于進一步驗證。而NRP2 被認為是某些實體腫瘤的潛在治療靶點，并且阻斷抗體和其他靶向工具已經在小鼠模型中得到了驗證。同時NRP1 已被作為癌癥治療的寡肽候選藥物成功地用于靶向治療淋巴瘤細胞。SEMA3F 的缺失是神經內分泌腫瘤的一個腫瘤前事件，而其受體NRP2 也可作為神經內分泌腫瘤的潛在治療靶點。

Bagri 等的研究表明NRP2 受體在VEGF-C 和SEMA3F 中都是常見的，這兩種配體在調控血管生成和淋巴管生成方面可能存在競爭關系，SEMA3F通過與VEGF-C 競爭與NRP2 結合而抑制淋巴管生成，發揮抗腫瘤作用。SEMA3F可以抑制體外VEGF誘導人臍靜脈內皮細胞的存活和增殖也可以抑制體內VEGF 誘導血管的生成；然而，這種抑制不是通過SEMA3F 和VEGF 之間的競爭介導的，而是在需要活躍的SEMA3F介導的信號傳導的細胞內水平上進行調節。SEMA3F 過度表達是否可用來抑制VEGF 的促血管生成和有絲分裂效應，以及當加入抗VEGF 治療時，外源性SEMA3F 治療是否具有相加或協同作用，仍需要進一步的研究去闡述。因此，針對SEMA 及其受體NRP 的干預可能是對抗癌癥進展的一種新的治療策略。

細胞周期阻滯、凋亡、DNA 修復和抗血管生成在內的四大類主要基因被認為參與了p53調節的腫瘤抑制的核心機制。腫瘤的萌發與生長與血管的產生密不可分，因此抗腫瘤的重要步驟是阻斷腫瘤血管的生成。p53 可激活抗血管生成因子基因的轉錄。SEMA3F 及其受體NRP2 作為腫瘤抑制基因p53的直接靶基因，可能在腫瘤發生過程中介導p53調節的抗血管生成，參與了抑癌通路。抗血管生成介質TSP1（血小板反應蛋白-1）和BAI1（腦特異性血管生成抑制因子1）是p53 的轉錄靶基因已被熟知。除了這些以外，SEMA3F 已成為第三個抗血管生成的靶基因。

慢性炎癥、自身免疫性疾病、癌癥輔助治療以及同種異體移植排斥反應可以通過靶向mTOR信號通路實現。mTOR 是由mTOR、Raptor 和mLST8（mTORC1，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合體1）或mTOR、Rictor、SIN1、Protor 和mLST8（mTORC2，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合體2）組成的一種絲氨酸/蘇氨酸激酶。對于大多數正常細胞類型生存所必需的細胞代謝、分化、增殖過程來說，mTORC1 和mTORC2 的信號傳導具有舉足輕重的作用。Nakayama 等的研究mTORC1以及mTORC2在膠質母細胞瘤細胞中可以被SEMA3F 抑制，而且mTORC2的其他靶標，如血清/糖皮質激素調節激酶-1（serum/glucocorticoid-regulated kinase-1，SGK1）和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC），也可被SEMA3F 抑制。總之，SEMA3F-NRP2 復合體是調節PI-3K-Akt/mTOR信號轉導活性的。SEMA3F 部分通過調節mTOR 活性抑制可誘導的VEGF 表達。SEMA3F-NRP2 復合體可以使細胞內PI-3K 通路活性受到抑制，減弱具有mTORC2 依賴性的信號傳導，降低RhoA（Ras 基因家族同源物A）活性以及減少細胞骨架應力纖維的形成。

4 總結

綜上所述，在腫瘤的發生、發展過程中，SEMA3F 以及NRP 扮演了重要角色。SEMA3F 的抗增殖和抗血管生成活性是其與NRP1 和NRP2 相互作用的結果，對于惡性腫瘤轉移有著決定性作用。基于目前的研究結果，為防止或延緩惡性腫瘤轉移，針對SEMA、NRP 的研究從未停止，SEMA3F 的全身治療是一種潛在的腫瘤微環境調節劑；然而，SEMA3F 在體內的安全性和穩定性還需進一步確認才能應用于臨床。該文章對SEMA及NRP在腫瘤微環境中對腫瘤的發生、發展進行綜述，以期對未來更多學者的實驗研究提供幫助。