桑黃酮G對缺血性中風大鼠血腦屏障的保護作用

劉少靜，騰軍放，許玉明，李玉生，張杰文，馬建軍

作者單位：1安鋼集團公司職工總醫院神經內科，河南 安陽455000；2鄭州大學第一附屬醫院神經內科，河南 鄭州450000；3河南省人民醫院神經內科，河南 鄭州450000

缺血性中風又稱作缺血性腦卒中，是最常見的一種腦卒中類型，其病理機制主要是由于顱內動脈管腔中血栓形成或栓子停留，血管出現狹窄和閉塞，造成相應供血區域血流降低、中斷，導致腦組織缺血、缺氧甚至壞死，進而產生一系列的神經缺損癥狀。大腦缺血缺氧會引起一系列病變，比如神經系統缺血缺氧性壞死、腦水腫、炎癥反應、氧化應激反應等，并表現出感覺和運動功能受損的神經功能缺損癥狀，重癥者意識喪失，是病人致殘、致死的主要原因。血腦屏障（BBB）是維持中樞神經系統微環境動態穩定的重要結構，主要由星形膠質細胞、內皮細胞（endothelial cells，ECs）、周細胞、細胞外連續的基底膜和細胞外基質及神經元構成神經血管單元。BBB選擇性通透結構受多種因素的共同調節，細胞間連續緊密連接（tight juctions，TJs）是保證BBB選擇性通透的重要結構之一，TJs中最主要的蛋白有胞質緊密黏連蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）、閉合蛋白（occludin）、緊密連接蛋白（claudin-5），其表達和分布與BBB的結構完整性密切相關，當發生缺血性中風時TJs表達明顯減少，TJs 結構松弛，BBB 完整性破壞；基質金屬蛋白9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）的激活使得基底膜降解，屏障結構進一步遭到損傷，這些蛋白的表達不僅與缺血性中風BBB結構密切相關，還參與多種退行性疾病的發生和發展。

桑黃酮G（kuwanon G，KG）是傳統中藥桑白皮的主要黃酮類化合物之一，已有研究表明，KG 可對抗口腔病原體的活性；Jung等發現KG 可以抑制卵白蛋白（ovalbumin，OVA）誘發的哮喘過敏小鼠模型中炎性細胞的浸潤并減少促炎細胞因子的分泌；KG 具有中值有效濃度（EC 50）（0.8±0.04）mg/L 和中位致死濃度（LC 50）（38.0±0.82）mg/L，可以安全、有效地控制魚鱗病。近期有研究發現運用人上皮結腸直腸腺癌（Caco-2）細胞構建體外腸道上皮屏障模型，探索KG 對LPS 誘導的上皮屏障的保護作用，發現KG 能夠抑制炎性因子（IL-1β 和TNF-α）的分泌，抗氧化應激作用，上調細胞連接蛋白ZO-1、Occludin和細胞間黏附分子（ICAM-1）的表達，同時升高內皮電 阻 值（Transendothelial electrical resistance，TEER），對腸道屏障有明顯的保護作用。本研究于2018年10月至2019年9月進行，運用大腦中動脈阻塞模型探討桑黃酮G對缺血性中風大鼠腦水腫及BBB 的影響，探索作用機制，為桑黃酮G 治療缺血性中風提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

45 只成年雄性健康的SD 大鼠，體質量范圍250～300 g，購自昆明國家生物產業基地實驗動物中心，許可證號SCXK（云）2018-0033。飼養室溫度（22±2）℃，相對濕度（50±10）%，自由進食和飲水，所有實驗動物均在相同條件下飼養，本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1.2 試劑和儀器

桑黃酮G 購自北京百靈威科技公司。zo-1 兔抗（Thermo）、VE-cadherin 兔抗（Abcam）、Occludin 兔抗（Abcam）、Claudin-5 兔抗（Abcam）、MMP-9 兔抗（Abcam）、β-actin 兔抗（Abcam）、Western Blot 一抗和二抗稀釋液（碧云天）、羊抗鼠DyLinght800熒光二抗（Thermo）、蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）（碧云天）、RIPA蛋白提取試劑盒（碧云天）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒（碧云天）、5×SDS 蛋白上樣緩沖液（碧云天）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（碧云天）、30%丙烯酰胺（Bio-Rad）、APS（Acros）、1.5M Tri-HCL（pH 6.8、8.8，上海雙螺旋）、蛋白分子量marker（Bio-Rad）、BSA（USA）、PVDF 膜（Bio-Rad）、MCAo 栓線（A4 級，北京西農科技有限公司）、SDS-PAGE 凝膠電泳轉膜裝置（Bio-Rad）、雙信道紅外線激光成像系統（Odyssey，Li-COR）。

1.3 動物分組與處理

采用隨機數字表法將45 只SD 成年雄性大鼠分為假手術組、模型組（MCAo）和治療組（KG），每組15 只。其中假手術組大鼠按模型分離血管后縫合，模型組和治療組大鼠建立大腦中動脈阻塞模型，治療組大鼠在手術前每日1 次定時灌服5 mg/kg的KG 預處理，連續灌服3 d，假手術組和模型組大鼠給予同體積的無菌水。術前禁食禁水8 h，術后繼續按術前灌服7 d后取材。

1.4 MCAo 模型的制備

根據Longa 等改良后的線栓法阻塞大腦中動脈模型制備本研究MCAo模型。剔除大鼠頸部皮膚備皮，75%的酒精棉球消毒備皮區域皮膚，用眼科剪于頸部正中間的位置做長約0.5 cm左右縱向切口，逐層剪開，分離出右側頸總動脈（CCA）、頸內動脈（ICA）和頸外動脈（ECA），分離開與血管相并行的神經及筋膜，并掛線備用。結扎CCA和ECA近心端，顯微剪在CCA近血管分叉口處剪一小缺口，將栓線由缺口處向ECA方向緩慢插入大腦中動脈（MCA）起始段，栓線標記長度到達CCA 與ICA、ECA分叉處時結扎ECA并固定栓線，清理切口處，逐層縫合。術后采用置于安靜空間單籠飼養，自由進食。

1.5 神經功能缺損評分

各組大鼠術后6 h、1 d、3 d、7 d 分別采用改良神經功能缺損程度評分（modified Neurological Severity Scores，mNSS）神經功能評分法評估神經功能缺損，總分為18 分，分數越高神經功能缺損越嚴重，0～7分均認為無缺損癥狀。

1.6 腦含水量測定

術后1 d、2 d、3 d、7 d，每組分別取3 只實驗大鼠，予以1%戊巴比妥鈉（4 mL/kg）腹腔麻醉，迅速分離取出大鼠全腦，稱量全腦組織濕重，隨后放入烘箱100 ℃，48 h 后稱量腦組織重量，即為干重，計算大腦含水量：含水量（%）=（濕重－干重）/濕重×100%。

1.7 蛋白質印跡法（western blotting）檢測大鼠腦組織中BBB相關蛋白的表達

每組分別選取3只大鼠，使用1%戊巴比妥鈉（4 mL/kg）腹腔麻醉，開胸充分暴露胸腔及心臟，將灌注針插入左心房并固定針頭，剪開右心耳，緩慢推注預冷的生理鹽水200 mL；小心剖開顱骨取出大腦，分離梗死側大腦組織，移入制冷的EP管中，剪成組織碎片，稱重，按（100 mg 組織樣品）/（200 μL 含0.01 mol/L PMSF的RIPA裂解液）比列進行，利用勻漿機裂解樣品，冰上操作，12 000 r/min，4 ℃15 min，收集離心所后得的將上清液即為所提取的總蛋白，根據BCA蛋白定量試劑盒測進行定量計算后稀釋樣品，加上樣緩沖液，煮沸10 min。每個樣品取30 μg蛋白上樣，同時在兩邊孔分別加入5 μL、2 μL Marker進行電泳，結束后采用濕轉2 h至PVDF膜上，脫脂奶粉室溫封閉1 h，根據分子量大小及Marker的位置切膜，分別加入MMP-9單克隆抗體（1∶1 000）、ZO-1單克隆抗體（1∶1 000）、Claudin-5單克隆抗體（1∶1 000）、Occludin 單克隆抗體（1∶5 000）和β-actin單克隆抗體（1∶5 000），4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗膜每5分鐘3次，避光加入羊抗鼠DyLinght800熒光二抗（1∶5 000），室溫避光孵育2 h，TBST 洗膜每5 分鐘3 次，使用Odyssey進行暗室發光得到條帶，使用Image J進行定量分析。

2 結果

2.1 KG 能顯著改善缺血性中風大鼠神經功能缺損

MCAo 模型制備后6 h、1 d、3 d、7 d，分別進行神經功能缺損評分檢測。mNSS 評分（

F

=22.37，

P

＜0.001）、時間（

F

=28.31，

P

＜0.001）及二者共同（

F

=15.73，

P

＜0.001）。結果發現，與假手術相比，模型組大鼠結果發現，與假手術組相比，模型組大鼠神經功能評分顯著升高，出現缺損表現，主要有感覺功能障礙、平衡能力下降、偏癱甚至無自主運動等中風表現。但是經過KG 治療后，1 d 能明顯改善缺損（

P

＜0.01），3 d、7 d改善更為明顯（

P

＜0.001）。見表1。

表1 各組大鼠神經功能評分統計/±s

2.2 KG能明顯減輕缺血性中風大鼠腦水腫

分別測量各組大鼠術后1 d、2 d、3 d、7 d，腦含水量（

F

=3.079，

P

＜0.05）、時間（

F

=143.6，

P

＜0.001）及二者共同（

F

=1.847，

P

＞0.05）。與假手術組相比，模型組大鼠大腦含水量增加（

P

＜0.001），且于2 d時腦水腫最為明顯；而經KG治療后，大腦含水量明顯下降（

P

＜0.001），說明KG可以顯著緩解缺血性中風大鼠腦水腫。見表2。

表2 各組大鼠腦含水量統計/±s

2.3 KG 能顯著上調ZO

-

1、Occludin 和Claudin

-

5的表達及下調MMP

-

9 的表達

造模后7 d 如方法所述運用Western blotting 檢測緊密連接蛋白ZO-1、Occludin 和Claudin-5 及基質金屬蛋白MMP-9 的表達。如圖1 及表3 所示，與假手術組相比，模型組緊密連接蛋白的表達明顯減少（

P

＜0.001），MMP-9 表達顯著升高（

P

＜0.001），而予以KG 治療后，緊密連接蛋白的表達顯著上調（

P

＜0.001），MMP-9 的表達顯著下調（

P

＜0.001）。結果表明KG 可通過上調ZO-1、Occludin 和Claudin-5 的表達，下調MMP-9 的表達減少基底膜的損傷，從而保護BBB完整性。

圖1 各組大鼠緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5及基質金屬蛋白MMP-9的表達

3 討論

桑白皮作為傳統常用中藥材，具有瀉肺平喘，行水消腫的功效，具有抗氧化應激、降血糖、抗癌、抗炎、保護腸屏障等作用。臨床上常用于治療水腫、咳嗽、糖尿病、氣管炎等疾病。然而對于缺血性中風的治療尚不明確，但研究已經表明對于腸道屏障完整性有一定的保護作用，那么設想可能對BBB也具有一定的保護作用，對腦水腫可能有調節作用。

BBB 是存在于血液循環與大腦內環境之間的嚴格的、動態的、選擇性的物理屏障，通常血液中的小分子物質（如：水、氧氣、葡萄糖、二氧化碳、氨基酸等）及有益物質能正常透過BBB，而大分子物質及有害物質（如外來藥物、氫離子、膽鹽及非脂溶性物質）幾乎不會通過BBB。中樞神經系統疾病及退行性疾病，如中風、腦外傷、阿爾海默茲病、帕金森等均會導致BBB的完整性破壞，引發生腦水腫、炎癥等，神經系統失去保護屏障，引發一系列的神經功能缺損癥狀。在本研究中，我們運用大鼠大腦中動脈阻塞模型，給予KG治療。結果顯示，MCAo大鼠神經功能明顯缺損，而予以KG治療后神經功能缺損狀況明顯得到改善；MCAo大鼠腦含水量增加，且術后2 d腦水腫最為嚴重，說明MCAo大鼠的確存在著腦水腫；而給予KG治療后，MCAo大鼠大腦含水量顯著下降，由此可見，KG可顯著減輕腦水腫。腦微血管內皮細胞之間廣泛的TJs作為維持BBB的完整性的主要結構，其緊密狀態及TJs蛋白的表達與BBB密切相關，ZO-1、occludin 和claudin-5是構成TJs 的重要分子蛋白，同時BBB結構的維持還有賴于基底膜的完整性，MMP-9表達減少有助于維持基底膜結構，這些分子的表達異常會導致TJs松弛及BBB的結構改變，缺血缺氧等變化常會導致ZO-1、Occludin 和Claudin-5的表達下降，這些分子的異常表達會嚴重破壞TJs結構，MMP-9的表達升高使基底膜的穩定破壞，會進一步加重BBB的損傷。而升高維持這些分子正常表達，能夠有效保護BBB，避免有害物質透過BBB進入大腦組織，損傷腦組織及大腦微環境。在本研究中，我們檢測到在MCAo模型大鼠腦組織中ZO-1、Occludin 和Claudin-5表達明顯下調，MMP-9表達明顯升高。而經過KG治療的MCAo大鼠，腦組織中ZO-1、Occludin 和Claudin-5表達明顯上調，MMP-9表達明顯抑制，這就提示KG能夠顯著上調Claudin-5、Occludin 和ZO-1 的表達水平，維持BBB 緊密連接，同時抑制MMP-9表達，減少基底膜的降解，進一步維持BBB結構的完整性。

表3 各組大鼠緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5及基質金屬蛋白MMP-9的表達/±s

總之，我們的研究結果表明MCAo 模型大鼠神經功能明顯損傷、腦水腫嚴重，其機制可能與緊密連接松弛，基底膜損傷，BBB完整性破壞有關；KG治療后明顯恢復了大鼠的神經功能，KG 發揮神經保護作用的機制可能是通過提高緊密連接蛋白Claudin-5、Occludin 和ZO-1 的表達，同時抑制MMP-9 激活，恢復緊密連接狀態及基底膜結構，維持BBB 完整性有關。我們的研究初步解釋了KG 腦保護的機制是通過對BBB 完整性的保護實現的，對于KG 其他的腦保護分子機制進一步深入研究，將有利于更好的開發和利用KG這一傳統中藥活性成分。