金桑顆粒的質量標準研究

李德林，任路路，李小偉，韓雙

作者單位：太和縣中醫院中藥制劑室，安徽 阜陽236600

小兒外感發熱常見于急性上下呼吸道感染、肺炎、支氣管炎等疾病，是兒科最常見的疾病。故深入研究有效治療小兒外感發熱的藥物尤為重要。目前國內外治療小兒外感發熱主要以合成藥物為主，雖有肯定的臨床療效，但只是對癥治療，無病因性的治療作用，使其臨床應用受到極大限制。因此，尋找有效、新型、低毒的治療小兒外感發熱藥十分必要。近年來現代基礎及臨床研究表明中醫藥在治療小兒外感發熱上不僅療效顯著，且毒副作用小，適合長期服用。

金桑顆粒處方系太和縣中醫院名老中醫依據清代醫學名家吳鞠通溫病理論，采取辨病與辯證的方法，對桑菊飲、銀翹散、清營湯等經典方劑進行化裁，并結合多年臨床經驗及幼兒發病特點，針對小兒外感發熱、咳嗽所總結的經驗方。本處方由金銀花、水牛角、桑葉、黃芩、連翹等十味藥配伍組合而成。方中金銀花疏散風熱，清熱解毒，用于各種熱病；水牛角清熱涼血，解毒定驚，以上二藥，共為君藥。桑葉清上焦風熱，善走肺絡，宣肺熱而止咳嗽；連翹氣味芳香，既能疏散風熱、清熱解毒，又可辟穢化濁；黃芩清熱燥濕，善清上焦之火；荊芥解表散邪，配入辛涼解表藥中，增強辛散透表之力，是為去性取用之法，四藥合用，助君藥發散表邪，透邪外出，俱為臣藥。蟬蛻既疏散肺經風熱而利咽透疹止癢，又長于疏散肝經風熱而涼肝息風止痙；白茅根清肺胃熱而利尿，又能涼血止血；熱易傷津，玄參滋陰降火解毒，淡豆豉解表除煩，上述四藥為佐藥。諸藥合用有止咳化痰兼疏風清熱之功。臨床常用于小兒外感疾病如感冒、慢性肺炎或支氣管炎引發的發熱、咳嗽等。該方原以湯劑形式在本院應用十余年，臨床療效顯著且安全可靠。為更好地發揮其療效，便于病人服用及攜帶，本研究在前期工作的基礎上，開發了金桑顆粒制劑。然而尚缺乏有效的質量控制方法，故為了更好的保證制劑質量及臨床用藥的安全性和有效性，2016年1—5月，本研究采用TLC 法對方中連翹及黃芩進行定性鑒別研究，同時采用HPLC 法對金桑顆粒中黃芩苷含量進行測定。該法操作簡便、專屬性強、穩定性及重復性良好，可有效控制金桑顆粒的質量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

XSE105DU型十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多）；Ultimate 3000 型高效液相色譜儀（賽默飛）；ZF-2 型三用紫外儀（上海市安亭電子儀器廠）；KQ-300DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；聚酰胺薄膜（國藥集團化學試劑有限公司）；硅膠G板（青島海洋化工廠分廠）；DHG-9055A型電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；HH數顯恒溫水浴鍋（常州國宇儀器制造有限公司）等。

1.2 試藥

黃芩苷對照品（批號110715-201317，供含量測定用）及連翹對照藥材（批號20908-201216，供薄層鑒別用）均來自中國食品藥品檢定研究院；金桑顆粒（批次20160328，20160329，20160330）、金桑顆粒缺連翹陰性樣品（批次20160412）、金桑顆粒缺黃芩陰性樣品（批次20160413），均為太和縣中醫院制劑室自制；甲醇為色譜純，水為純化水，乙醇、乙酸乙酯及甲酸等其他試劑均為分析純。

2 薄層色譜鑒別

2.1 連翹的薄層色譜鑒別

取金桑顆粒樣品10 g，研細，加乙醇30 mL，超聲30 min，濾過，濾液濃縮至l mL，加中性氧化鋁l g，在水浴上拌勻，干燥，加在中性氧化鋁柱（100～200 目，2 g，內徑為15 mm）上，加無水乙醇50 mL 洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加無水乙醇l mL 使溶解，即得供試品溶液。另取連翹對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。再按金桑顆粒制備工藝生產不含連翹的樣品，同法制得缺連翹陰性對照溶液。照TLC 法（中國藥典2015年版四部通則0502）試驗，吸取上述對照藥材溶液5 μL、三批供試品溶液及陰性對照溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（9∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛乙醇溶液與硫酸的混合溶液（18∶1），在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。結果供試品溶液色譜中，在與連翹對照藥材溶液色譜相應位置上，顯相同顏色的黃褐色主斑點，斑點清晰可見，分離效果較好，且陰性對照無干擾，專屬性較好，三批金桑顆粒均檢出連翹。

2.2 黃芩的薄層色譜鑒別

取金桑顆粒樣品5 g，研細，加入甲醇50 mL，超聲30 min，過濾，濾液蒸干，殘渣加水30 mL 使溶解，用鹽酸調節pH 至1.0～2.0，乙酸乙酯振搖提取2 次，每次30 mL，分取乙酸乙酯層，水浴蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，即得供試品溶液；另取黃芩苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作為對照品溶液；再按金桑顆粒制備工藝生產不含黃芩的樣品，同法制得缺黃芩陰性對照溶液。照TLC 法（中國藥典2015年版四部通則0502）試驗，吸取上述三種溶液各5 μL，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5∶3∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鐵乙醇溶液。結果供試品溶液色譜中，在與黃芩苷對照品溶液色譜相應的位置上，顯相同顏色的綠色斑點，斑點清晰可見，分離效果較好，且陰性對照無干擾，專屬性較好，三批金桑顆粒均檢出黃芩。

3 黃芩苷HPLC含量測定

3.1 色譜條件

色譜柱為依利特Hypersil ODS2柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸（47∶53）；流速設置為1.0 mL/min；柱溫設置為30 ℃；檢測波長為280 nm；理論塔板數按黃芩苷峰計應不得低于2 500，進樣量設置為5 μL。

3.2 對照品溶液的制備

稱取黃芩苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含22.44 μg 的黃芩苷對照品溶液，搖勻，即得。

3.3 供試品溶液的制備

取金桑顆粒約0.5 g，研細，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理30 min（功率250 W，頻率20 kHz），取出，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密移取續濾液2 mL 置10 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

3.4 陰性對照溶液的制備

按金桑顆粒處方和制備工藝制備缺黃芩的陰性樣品，再按“3.3”項下方法制備缺黃芩陰性對照溶液。

3.5 專屬性試驗

按“3.1”項下色譜條件，分別吸取上述供試品溶液、黃芩苷對照品溶液和陰性對照溶液各5 μL，注入液相色譜儀中，記錄各自色譜圖。結果供試品色譜中，在與對照品色譜相同的保留時間內出現黃芩苷色譜峰，且黃芩苷分離度及拖尾因子均符合要求，而陰性對照無干擾，故該法專屬性良好。見圖1。

3.6 線性關系考察

取“3.2”項下的黃芩苷對照品溶液適量，置自動進樣器中，分別吸取3 μL、4 μL、5 μL、6 μL、7 μL于液相色譜儀中，再按上述“3.1”項下色譜條件進樣，并記錄峰面積。并以黃芩苷對照品進樣量（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，進行線性回歸。結果得黃芩苷的回歸方程為：Y=0.057 1 X+0.081 2（r=0.999 9），以上結果表明黃芩苷在進樣量為0.067 3 mg～0.157 0 mg范圍內呈現良好的線性關系。

圖1 供試品和對照品HPLC圖：A為黃芩苷對照品；B為金桑顆粒樣品；C為陰性對照

3.7 精密度試驗

取“3.2”項下黃芩苷對照品溶液適量，置自動進樣器中，按“3.1”下的色譜條件，連續進樣6 針，測定黃芩苷峰面積。結果黃芩苷平均峰面積為6.600，RSD 為0.28%（

n

=6），說明該儀器精密度良好。

3.8 穩定性試驗

取金桑顆粒0.5 g，按“3.3”下制備方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件，將供試品溶液置于自動進樣器中，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h 進樣測定，并記錄黃芩苷峰面積，結果黃芩苷平均峰面積為6.000。RSD 為0.33%（n=8），表明金桑顆粒供試品溶液在室溫放置24 h內較為穩定。

3.9 重復性試驗

精密稱取同一批次的金桑顆粒6份，每份約0.5 g，精密稱定，按上述“3.3”項下供試品溶液制備方法平行制備6份供試品溶液，置于自動進樣器中，再按上述“3.1”項下色譜條件進樣，測定黃芩苷峰面積并計算其黃芩苷含量。結果顯示6份樣品的黃芩苷平均含量為9.86 mg/g，RSD為1.20%。表明該法重復性較好。

3.10 加樣回收率試驗

取已知含量的同一批金桑顆粒樣品6份（批號：20160328）適量，分別精密加入濃度為2.891 4 mg/mL的黃芩苷對照品溶液1 mL，揮干溶劑后，按上述“3.3”項下方法制備供試品溶液，置于自動進樣器中，再按上述“3.1”項下色譜條件，測定黃芩苷峰面積并計算其黃芩苷加樣回收率。結果6份樣品的平均回收率為96.72%，RSD 為0.35%。表明樣品回收率良好，該法準確度較高。見表1。

表1 金桑顆粒黃芩苷加樣回收率結果（n=6）

3.11 樣品含量測定及含量限度的確定

通過投料前對處方中黃芩飲片及三批金桑顆粒樣品中黃芩苷含量的測定，計算得到黃芩苷的轉移率。結果表明，不同批次的黃芩飲片中黃芩苷的含量分別為13.67%、13.46%、13.08%，三批金桑顆粒中黃芩苷的含量分別為9.63mg/g、9.70 mg/g、9.70 mg/g。因處方中每1 g顆粒含黃芩飲片0.12 g，則制劑中理論每1 g含黃芩苷分別為16.40 mg、16.15 mg、15.70 mg，最低轉移率為58.72%。根據2015年版《中國藥典》一部規定：黃芩飲片中黃芩苷的含量不得少于8.0%（80 mg/g），則制成制劑后相當于每1g含黃芩苷不得少于9.6 mg，此工藝中黃芩苷轉移率在58.72%～61.78%之間，制成制劑后最低應為：5.637～5.931 mg/g，則裝量差異項下的本品每袋應為56.37～59.31 mg。結合多批制劑含量測定結果及生產實際，故本標準將黃芩苷的限度暫定為不少于每袋55.0 mg。見表2。

表2 黃芩苷含量和轉移率考察結果

4 討論

4.1 薄層鑒別

在對制劑中的連翹薄層鑒別時，曾參考相關文獻，試以乙醇超聲提取點樣，但所含雜質多，日光下檢視不清楚，故增加對提取液過大孔吸附樹脂柱或中性氧化鋁柱純化過程，結果發現中性氧化鋁柱分離效果更好，斑點清晰，專屬性更強。此外，本研究還參考相關文獻對方中其他藥味如金銀花、桑葉等進行了薄層鑒別研究，結果發現金銀花、桑葉、淡豆豉及玄參陰性對照有干擾，荊芥及白茅根分離效果較差且斑點較不清晰，故暫未列入質量標準中，有待于進一步研究。

4.2 提取方法的優化

本研究前期曾對方中君藥金銀花主要成分綠原酸和木犀草苷進行含量測定，結果發現金銀花陰性對照中綠原酸存在干擾，且樣品中木犀草苷含量極低，故本研究選擇臣藥黃芩的主要成分黃芩苷作為含量測定指標，為了充分提取樣品中的黃芩苷，本研究考察了超聲提取和回流提取兩種方法，研究結果表明二者黃芩苷含量無顯著性差異，但超聲提取更為簡便，故選擇超聲提取。同時參考相關文獻，考察了30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇等不同比例的甲醇和超聲時間20 min、30 min及40 min對提取效果的影響。結果表明以50%甲醇為溶劑，超聲處理30 min，黃芩苷提取效果最佳。

4.3 流動相和色譜柱的考察

金桑顆粒為中藥復方制劑，方中干擾成分較多，故流動相的優化和色譜柱的選擇對樣品的分離有著重要的影響。本實驗考察了甲醇-水溶液及甲醇-磷酸水溶液。結果發現試驗中以甲醇-水為流動相時，峰形拖尾，而加入0.1%磷酸后，拖尾現象得到改善，且分離度符合要求。此外，本研究對不同品牌的色譜柱（Thermo Syncronis C18、Wonda Cract ODS2、Hypersil ODS2）進行比較，結果發現Thermo Syncronis C18柱上黃芩苷分離度較差，Hypersil ODS2較Wonda Cract ODS2出峰時間短且分離效果較好。故本研究選擇以甲醇-0.1%磷酸水溶液和Hypersil ODS2柱作為最佳流動相和色譜柱。

綜上所述，本研究建立的連翹、黃芩的TLC 鑒別陰性對照無干擾、斑點清晰且專屬性較強。黃芩苷的含量測定方法簡便易行，重現性較好，為控制和評價金桑顆粒的質量提供科學依據。