益腎降糖膠囊質量控制方法的研究

黃燕，單麗，邱水生，潘旭東，林雄，羅花彩

作者單位：福建中醫藥大學附屬人民醫院，福建 福州350004

益腎降糖膠囊是由我院院內制劑益腎降糖飲（閩藥制字Z061060503）劑型改革而得的復方制劑。該方是阮詩瑋教授總結古今文獻，結合多年臨床經驗，在中醫理論指導下自創的經驗方。其處方以制何首烏、赤芍、黃芩、太子參、黃芪、山藥、肉蓯蓉等14味藥材組成，具有滋陰養血、益腎通絡之功效。該制劑臨床應用于腎氣虧虛、陰血虧損、脈絡瘀阻等特點的糖尿病腎病，能夠有效降低尿微量白蛋白，血漿同型半胱氨酸水平，延緩病情進展的速度，臨床應用幾十年，效果良好。原制劑質量標準簡單，只對方中黃芪、赤芍進行薄層鑒別，無含量測定項目。因劑型由合劑改為膠囊劑，樣品處理方法不同，故本研究于2018年9月至2019年12月對原標準中薄層鑒別項目進行整合優化，重新建立了制何首烏、赤芍、玄參、黃芪、山藥、黃芩的薄層色譜鑒別。方中制何首烏為君藥，具有補肝腎，益精血，烏須發，強筋骨，化濁降脂的作用，其專屬有效成分2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-0-β-D葡萄糖苷（簡稱二苯乙烯苷）具有抗氧化、神經保護、肝臟保護、防治老年癡呆等作用，常作為制何首烏質控指標成分。赤芍、黃芩為臣藥，赤芍的主要成分芍藥苷具有抗自由基損傷、降低血液黏度，抗血小板聚集，改善微循環、抗氧化等作用，黃芩的主要成分黃芩苷具有解熱抗炎、清除自由基、抗氧化、心腦血管保護等作用。制何首烏、赤芍、黃芩在益腎降糖膠囊中起至關重要作用，為了完善其質量標準，增加了含量測定項目，采用高效液相色譜法對芍藥苷、二苯乙烯苷、黃芩苷同時進行測定，為該制劑質量標準的建立提供一定的參考依據。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

HWS26 型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司），WD-9403A 型紫外儀（北京市六一儀器廠），98-1-B 型電子調溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司），循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司），KQ-500DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），CPA-225D 型電子分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司），Ulit Mate-3000型高效液相色譜儀（戴安中國有限公司）。

1.2 試劑

制何首烏對照藥材（批次121454-201405），玄參對照藥材（批次121008-201609），山藥對照藥材（批次121137-201603），大黃素對照品（批次110756-200110，含量98.7%），芍藥苷對照品（批次110736-201842，含量97.4%），哈巴俄苷對照品（批次111730-201709，含量95.9%），黃芪甲苷對照品（批次110781-201717，含量96.9%），2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-0-β-D 葡萄糖苷對照品（批次110844-201713，含量93.6%），黃芩苷對照品（批次110715-201720，含量93.5%），以上均購自中國食品藥品檢定研究院；硅膠G層析板（批次20180908，青島海洋化工廠），甲醇（色譜純，批次20180422國藥集團化學試劑有限公司），其余試劑為分析純；益腎降糖膠囊（批次20181101，20181105，20181108，20181110，0.43 克/粒，福建中醫藥大學附屬人民醫院制劑室）。

2 方法與結果

2.1 定性鑒別

2.1.1

制何首烏的薄層鑒別 稱取益腎降糖膠囊（批次20181101，20181105，20181108）內容物10 g，加2.5 mol/L 硫酸和三氯甲烷各30 mL，搖勻，水浴加熱回流40 min，冷卻，取三氯甲烷層，水層再用三氯甲烷20 mL振搖提取，三氯甲烷提取液合并，水浴蒸干，用三氯甲烷溶解殘渣并定容至1 mL，制成供試品溶液。另稱取制何首烏對照藥材0.2 g，照上述方法制備對照藥材溶液。取不含制何首烏的供試品，同法制備缺制何首烏的陰性對照溶液，再取大黃素對照品適量，加三氯甲烷溶解，制成每1毫升含0.5 mg大黃素的對照品溶液。取上述供試品、缺制何首烏陰性對照溶液各10 μL，對照品和對照藥材溶液各5 μL，在同一硅膠G層析板上分別點樣，取甲苯—乙酸乙酯—甲酸（體積比為20∶2∶1）的上層溶液置層析缸中，預飽和15 min，薄層板展開至適宜高度，取出，自然晾干，置紫外光燈（365 nm）下觀察。薄層色譜中，供試品、對照品、對照藥材溶液色譜在薄層板相對應的位置呈同樣的黃色斑點，且斑點分離良好，而陰性對照無同樣的干擾斑點。該法操作簡單，具重現性，可用于方中制何首烏的鑒別。見圖1A。

2.1.2

赤芍、玄參的薄層鑒別 稱取益腎降糖膠囊（批次20181101，20181105，20181108）內容物10 g，加甲醇40 mL，搖勻，超聲提取（500 W，40 kHz）30 min，離心，上清液水浴蒸干，用水20 mL 溶解殘渣，加正丁醇振搖提取2 次，每次25 mL，合并正丁醇提取液，水浴蒸干，用甲醇溶解殘渣并定容至1 mL，制成供試品溶液。另取玄參對照藥材1 g，照上述方法制備對照藥材溶液。分別取不含赤芍、不含玄參的供試品，同法制備缺赤芍、缺玄參的陰性對照溶液。再取哈巴俄苷、芍藥苷對照品適量，分別加甲醇溶解，分別制成每1 毫升含1 mg 哈巴俄苷、芍藥苷的對照品溶液。取上述對照品、對照藥材溶液各5 μL，供試品及缺玄參、缺赤芍的陰性對照溶液各10 μL，在同一硅膠G 層析板上分別點樣，以三氯甲烷—甲醇—水（體積比為12∶4∶1）的下層溶液為展開劑，薄層板展開至適宜高度，取出，自然晾干，5%香草醛硫酸溶液噴霧顯色，加熱至斑點顏色清晰，置日光燈下檢視。薄層色譜中，供試品與對照品和對照藥材溶液色譜在相對應的位置呈同樣顏色的斑點，且斑點分離良好，而陰性對照溶液無同樣的干擾斑點。該法操作簡單，具重現性，可用于方中赤芍與玄參的鑒別。見圖1B。

2.1.3

黃芪的薄層鑒別 稱取益腎降糖膠囊（批次20181101，20181105，20181108）內容物15 g，加甲醇30 mL，搖勻，超聲提取（500 W，40 kHz）30 min，離心，上清液水浴蒸干，加水20 mL 溶解殘渣，用水飽和的正丁醇振搖提取2 次，每次20 mL，合并正丁醇提取液，加氨試液洗滌2次，每次20 mL，棄去氨試液，再用正丁醇飽和的水洗滌2 次，每次30 mL，棄去水液，取正丁醇提取液水浴蒸干，用甲醇溶解殘渣并定容至1 mL，制成供試品溶液。另取不含黃芪的供試品，同法制備缺黃芪的陰性對照溶液。再取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇溶解，制成每1 毫升含1 mg黃芪甲苷的對照品溶液。取上述3種溶液各10 μL，在同一硅膠G層析板上分別點樣，以三氯甲烷—甲醇—水（13∶7∶2，

V/V/V

）的下層溶液為展開劑，展開至適宜高度，取出，自然晾干，用10%硫酸乙醇溶液噴霧顯色，加熱至斑點顏色清晰，置日光燈下觀察。薄層色譜中，供試品與對照品溶液色譜在相對應位置呈同樣顏色的斑點，且斑點分離良好，而陰性對照溶液無同樣顏色的干擾斑點。該法操作簡單，具重現性，可用于方中黃芪的鑒別。結果見圖1C。

2.1.4

山藥的薄層鑒別 稱取益腎降糖膠囊（批次20181101，20181105，20181108）內容物10 g，加二氯甲烷30 mL，搖勻，回流加熱2 h，冷卻，離心，上清液水浴蒸干，用二氯甲烷溶解殘渣并定容至1 mL，制成供試品溶液。另取山藥對照藥材2 g，照上述方法制備對照藥材溶液。取不含山藥的供試品，同法制備缺山藥的陰性對照溶液。取上述溶液各10 μL，在同一硅膠G 層析板上分別點樣，以三氯甲烷—丙酮（10∶0.5

，V/V

）為展開劑，展開至適宜高度，取出，自然晾干，用5%香草醛硫酸溶液噴霧顯色，加熱至斑點顯色清晰，在日光燈下檢視。薄層色譜中，供試品與對照藥材溶液在相對應位置呈同樣顏色斑點，且斑點分離良好，而陰性對照無同樣顏色的干擾斑點。該法操作簡單，具重現性，可用于方中山藥的鑒別。結果見圖1D。

2.1.5

黃芩的薄層鑒別 稱取益腎降糖膠囊（批次20181101，20181105，20181108）內容物10 g，加乙酸乙酯—甲醇（3：1）20 mL，回流加熱30 min，冷卻，離心，取上清液水浴蒸干，用甲醇溶解殘渣并定容至1 mL，制成供試品溶液。另取不含黃芩的供試品，同法制備缺黃芩的陰性對照溶液。再取黃芩苷對照品適量，加甲醇溶解，制成每1 毫升含1 mg 黃芩苷的對照品溶液。取上述溶液各10 μL，在同一硅膠G 層析板上分別點樣，以乙酸乙酯—丁酮—甲酸—水（5∶3∶1∶1，

V/V/V/V

）為展開劑，展開至適宜高度，取出，自然晾干，用2%三氯化鐵乙醇溶液噴霧顯色，加熱至斑點顏色清晰，在日光燈下觀察。薄層色譜中，供試品與對照品溶液在相對應的位置呈同樣的暗綠色斑點，且斑點分離良好，而陰性對照無同樣顏色的干擾斑點。該法操作簡單，具重現性，可用于方中黃芩的鑒別。結果見圖1E。

2.2 含量測定（避光操作）

2.2.1

色譜參數的選擇 Ultimate? XB-C色譜柱（4.6×250 mm，5 μm）；以甲醇（A）-0.2%磷酸溶液（B）為流動相，進行梯度洗脫（0～15 min，30%A，15～20 min，30%～50% A，20～30 min，50% A，30～35 min，50%～30% A）；檢測波長設置芍藥苷為230 nm，二苯乙烯苷和黃芩苷為320 nm；柱溫40 ℃；流速為1.0 mL/min；進樣量10 μL。在上述色譜條件下，供試品中芍藥苷、二苯乙烯苷、黃芩苷與其他成分均分離良好，分離度均＞1.5，陰性對照溶液色譜相應位置未顯示相同的吸收峰，理論板數以芍藥苷、二苯乙烯苷、黃芩苷峰計均不低于3 000，結果見圖2。

圖2 高效液相色譜圖：A為對照品溶液（λ=230 nm）；B為供試品溶液（λ=230 nm）；C為缺赤芍陰性溶液（λ=230 nm）；D為對照品溶液（λ=320 nm）；E為供試品溶液（λ=320 nm）；F為缺首烏陰性溶液（λ=320 nm）；G為缺黃芩陰性溶液（λ=320 nm）

2.2.2

對照品混合溶液的配制 分別取芍藥苷、黃芩苷、二苯乙烯苷對照品適量，精密稱定，分別置棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，分別制成每1 毫升含芍藥苷0.391 5 mg、黃芩苷0.451 0 mg、二苯乙烯苷0.246 2 mg的各對照品貯備液；再精密量取上述芍藥苷貯備液5 mL、黃芩苷貯備液5 mL、二苯乙烯苷貯備液1 mL，置同一25 m L 棕色容量瓶中，加甲醇定容，混合均勻，制成每1 毫升含芍藥 苷78.300 μg、黃 芩 苷90.200 μg，二 苯 乙 烯 苷9.848 μg的混合對照品溶液。

2.2.3

供試品溶液的配制 取益腎降糖膠囊2 粒，倒取內容物混合均勻，取0.34 g，精密稱定，置于碘量瓶中，精密加入稀乙醇溶液10 mL，稱定重量，超聲處理（500 W，40 kHz）30 min，冷卻，繼續稱定重量（用稀乙醇溶液補足減失的重量），搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.2.4

陰性對照溶液的配制 分別取不含赤芍、制何首烏、黃芩的陰性樣品，按“2.2.3”項下的制備方法分別制成缺赤芍、制何首烏、黃芩的陰性溶液。

2.2.5

線性關系考察 分別精密吸取適量的二苯乙烯苷、芍藥苷、黃芩苷對照品貯備液，制成每1 毫升含二苯乙烯苷分別為3.939，4.924，7.878，9.848，14.772 μg，含 芍 藥 苷 分 別 為31.320，78.300，117.450，156.600，234.900 μg，含 黃 芩 苷36.080，90.200，135.300，180.400，270.600 μg 的5 個系列對照品混合溶液。按“2.2.1”項下設定的色譜參數，上述5個對照品混合溶液各精密吸取10 μL，分別進樣進行測定，記錄各濃度對照品混合溶液的峰面積。采用Chromeleon 色譜工作站軟件進行統計分析，以峰面積（Y^）為縱坐標，對照品質量濃度（

X

）為橫坐標進行線性回歸，計算回歸方程，二苯乙烯苷、芍藥苷、黃芩苷的回歸方程分別為

Y

^=0.602 3

X

-0.034 0（

r

=0.999 5），

Y

^= 0.185 2

X

+ 0.542 2（

r

=0.999 1），

Y

^=0.321 0

X

+ 0.875 2（

r

=0.999 5），結果表明二苯乙烯苷 在3.939 ～14.772 μg/mL，芍 藥 苷 在31.320 ～234.900 μg/mL，黃芩苷在36.080 ～270.600 μg/mL范圍與峰面積具有良好的線性關系。

2.2.6

精密度試驗 精密吸取“2.2.2”項下的對照品混合溶液10 μL，按照“2.2.1”項下設定的色譜參數依次進樣6次，記錄對照品混合溶液的峰面積。結果，芍藥苷、黃芩苷、二苯乙烯苷測得峰面積的相對標準偏差（RSD）分別為1.07%，0.92%，0.79%（

n

=6）。

2.2.7

重復性與穩定性試驗 取同一批益腎降糖膠囊（批次20181110），按照“2.2.3”項下的制備方法制備供試品溶液6 份，再分別精密吸取10 μL，按照“2.2.1”項下設定的色譜參數依次進樣分析。結果，芍藥苷、黃芩苷、二苯乙烯苷平均質量分數分別為4.452 0 mg/g，6.210 5 mg/g，0.225 1 mg/g；RSD 分別為0.48 %，0.15%，0.57 %；表明該測定方法具有良好的重復性。再取上述供試品溶液1份，于0，4，8，12，24 h 分別進樣，每次進樣10 μL，測定供試品各成分的峰面積。結果，供試品中芍藥苷、黃芩苷、二苯乙烯峰面積的RSD 分別為0.76 %，0.80%，0.59 %。說明益腎降糖膠囊供試品溶液中芍藥苷、黃芩苷、二苯乙烯苷用該方法測定在24 h 內保持穩定。

2.2.8

加樣回收率試驗 取上述重復性試驗測定的益腎降糖膠囊6份，每份0.17 g，精密稱定，分別置于10 mL 容量瓶中，精密加入芍藥苷對照品貯備液2 mL、二苯乙烯苷對照品貯備液0.15 mL，黃芩苷對照品貯備液2.3 mL，按照供試品溶液制備方法制備加樣回收率試驗供試品溶液，按“2.2.1”項下設定的色譜參數進樣測定供試品中芍藥苷、二苯乙烯苷、黃芩苷的含量，并計算各成分的加樣回收率。芍藥苷、黃芩苷、二苯乙烯苷、的平均回收率分別為98.96 %，99.91 %，99.89%；RSD 分別為0.76 %，1.16%，1.41%；表明采用該方法測定益腎降糖膠囊中芍藥苷、黃芩苷、二苯乙烯苷的含量，回收率良好，結果準確可靠。結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n=6）

2.2.9

樣品的測量 分別取不同批次的益腎降糖膠囊3 批，按照“2.2.3”的方法制備益腎降糖膠囊供試品溶液3 份，按“2.2.1”項下設定的色譜參數測定供試品溶液中芍藥苷、二苯乙烯苷、黃芩苷的峰面積，并以“2.2.5”項下各成分的標準曲線計算含量，見表2。

表2 樣品含量測定結果（n=3）

3 討論

3.1 薄層鑒別藥味的選擇

預試驗中，對方中的10味藥材進行了薄層色譜鑒別，當歸、蒼術的對照藥材有熒光斑點，而樣品在相應位置無相同的熒光斑點；方中肉蓯蓉的鑒別，供試品與對照藥材在相同位置有相應的斑點，但斑點不清晰，拖尾明顯；方中太子參的鑒別，按《中國藥典》一部（2015年版）太子參項下的方法進行檢測，結果薄層色譜顯示，供試品與對照藥材在相應位置上顯同樣顏色的斑點，但陰性對照樣品有同樣的干擾斑點；故當歸、蒼術、肉蓯蓉、太子參未納入現質控方法中。其他6 味藥的薄層鑒別圖譜斑點清晰可見，分離度良好，專屬性強；其中赤芍與玄參是在原標準基礎上，進行優化，同時檢測，簡化了步驟，節約成本。

3.2 提取方法的選擇

含量測定項目下供試品溶液的制備在提取時，提取溶劑分別考察了甲醇、50%甲醇、稀乙醇和70%乙醇4種溶劑；提取方法采用超聲提取和水浴加熱回流提取兩種方法，提取時間考察了15，30，45和60 min，結果顯示采用稀乙醇超聲提取30 min，測得各成分含量最高，且該提取方法操作簡單可行，故最終提取方法采用稀乙醇超聲提取30 min。

3.3 檢測波長的選擇

芍藥苷、二苯乙烯苷、黃芩苷的最大吸收波長分別為230，280，320 nm。230，280 nm處3個成分均有吸收，320 nm處芍藥苷無吸收；其中二苯乙烯苷在230、280 nm 處的吸收較小，且樣品中二苯乙烯苷含量較低，故選擇其最大吸收波長320 nm 作為測定波長；黃芩苷在320 nm，280 nm 處的吸收均較大，且在兩波長處測量結果基本一致；芍藥苷在230 nm處吸收最強，故最終確定230 nm波長測定芍藥苷，320 nm波長測定二苯乙烯苷和黃芩苷。

3.4 流動相的選擇

流動相的組成及比例對樣品峰的峰型及出峰時間都有很大的影響，曾考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液等體系，在試驗過程中發現，采用甲醇-0.2%磷酸溶液體系時，三成分峰型比較對稱，故選擇作為流動相體系。多次試驗發現甲醇-0.2%磷酸溶液的比例大于40∶60 時，芍藥苷與二苯乙烯苷出峰時間接近，兩成分無法完全分開，而流動相比例低于40∶60時，黃芩苷的出峰時間在60 min 左右，檢測時間較長。綜合考慮各因素，最終確定梯度洗脫，三種成分得到良好的分離，且檢測時間控制在40 min 以內，提高了效率。

綜上所述，本質控方法可操作性強，具有良好的重現性，檢測結果準確度高，可用于益腎降糖膠囊的質量控制。