間歇性缺氧通過上調蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白通路促進S180實體瘤的生長

楊盼，成林杰，單瑋碧，艾孜買提·肉孜江，姚巧玲

作者單位：新疆醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊830011

睡眠呼吸暫停綜合征（Obstructive sleep apnea，OSA）是一種以睡眠中反復發(fā)生的上呼吸道完全或部分塌陷而造成的通氣中斷為特征的睡眠障礙性疾病。可導致多個臟器的損害，包括心血管系統(tǒng)損害，代謝功能損害及大腦認知功能障礙，可嚴重影響患者的生活質量和壽命。其中間歇性缺氧（Intermittent hypoxia，IH）是OSA的主要標志和特征。

將動物暴露于IH 是一種常見的OSA 動物實驗模型，有研究表明IH可促進腫瘤的生長和轉移。Akt／mTOR（蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白）信號通路作為腫瘤領域的研究熱點，被證明在多種腫瘤中異常激活，調控腫瘤細胞的存活、增殖及遷移。研究發(fā)現(xiàn)Akt／mTOR信號通路的活化可為細胞的生長、蛋白質的合成提供有利條件，進而為細胞的抗凋亡提供途徑。Akt/mTOR 信號通路和凋亡是否在OSA 合并腫瘤的發(fā)生和進展中發(fā)揮調控作用，目前國內外均沒有報道。2018年3—5月，選用在新疆醫(yī)科大學動物房購買的8 周齡清潔級昆明鼠制備IHS180實體瘤模型，探討Akt／mTOR信號通路及凋亡在OSA合并腫瘤發(fā)病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8 周齡的昆明小鼠（雄性）16 只，體質量（21±2）g，購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心[許可證號SCXK（新）2018-0001）］。實驗期間，室溫在22 ℃左右，照明時間為9：00-21：00，小鼠自由飲水和喂食，本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1.2 實驗儀器及試劑

S180實體瘤（贈送），胎牛血清（10091-148），美國Gibco，0.25%胰酶（J112861）、雙抗（SV30010）、DMEM 高糖（SH30022.0）購置于美國Hyclone，TUNEL 試劑盒（MK1028）購于博士德生物，BCA 蛋白定量試劑盒（UB276927）、RIPA 裂解液（TK274910）購置于美國Thermo，蛋白激酶B（Akt、#4865）、磷酸化Akt（p-Akt、#4060）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR、#2983）、磷酸化mTOR（p-mTOR、#5536）兔來源的單克隆抗體購置于美國CST公司。

1.3 實驗方法

1.3.1

細胞培養(yǎng)及處理 將S180 實體瘤放于含10%胎牛血清及DMEM 高糖的完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長情況進行傳代，離心去上清，加入完全培養(yǎng)液吹打，使細胞懸浮于完全培養(yǎng)液中，并進行細胞計數(shù)，調整濃度為1×10/mL，取3 只正常的小鼠，每只鼠腹腔打0.2 mL 的細胞懸液，制備惡性腹水瘤小鼠模型。10 d 后，選取生長良好的S180 荷瘤小鼠（腹水型）無菌條件下抽取腹水，以完全培養(yǎng)液1∶1 稀釋成瘤細胞懸液，制成1×10/mL 的細胞懸液備用，每只小鼠接種0.2 mL（細胞數(shù)2×10個）。

1.3.2

動物模型的建立 腫瘤接種：用75%乙醇消毒小鼠腋下，細胞懸液在使用前用槍混勻，然后用1 mL無菌注射器吸取0.2 mL的懸液，并將其接種于小鼠左前肢腋下部皮下，形成圓形小皮丘，注射完停10 s，出針。

缺氧的暴露：把接種S180實體瘤的小鼠采用隨機數(shù)字表法隨機分為RA 組和IH 組。IH 按照本課題組以往的造模方式進行，小鼠放到缺氧箱中，IH循環(huán)由30 s 氮氣和30 s 氧氣組成，每個IH 循環(huán)是1 min，氧的最低濃度為（7±1）%，IH 暴露時間為9：00～21：00，連續(xù)2 周。RA 組小鼠在普通鼠籠進行飼養(yǎng)，IH 組和RA 組小鼠在同一房間，實驗期間，所有小鼠自由飲水和進食。IH 暴露兩周后，小鼠稱體質量，用4%水合氯醛麻醉，取腫瘤組織稱重，一半組織液氮速凍，保存于-80 ℃?zhèn)溆?；另一半組織浸泡在4%甲醛里面，用于石蠟切片。

1.3.3

腫瘤組織細胞凋亡檢測 4%甲醛固定后，腫瘤組織常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片；取石蠟切片，按照TUNEL 檢測試劑盒說明書進行凋亡檢測，每組隨機選擇5個視野，計數(shù)凋亡小體，取均數(shù)。

1.3.4

Western blotting 檢測蛋白表達 取適量腫瘤組織，加入已配好的含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，充分混勻，剪碎，超聲。冰上裂解30 min，裂解完成后，在4 ℃，12 000 r/min條件下離心20 min，收集上清，BCA法測定蛋白濃度。配膠，依次進行電泳和轉膜，隨后用1%的BSA進行封閉1 h，一抗孵育，4 ℃過夜（Akt、p-Akt的抗體稀釋比為1∶1 000，mTOR、p-mTOR及β-actin抗體稀釋比為1∶2 000），TBST洗3次，每次5 min。二抗孵育1 h 后，TBST 洗3 次，采用ECL法顯色，將條帶置于成像儀中，拍照并保存。蛋白條帶灰度值用Image J計算、分析。

2 結果

2.1 腫瘤組織質量占比情況

小鼠瘤質量RA組和IH 組小鼠腫瘤組織的質量分別為0.22（0.15，2.30）和2.76（1.93，4.14），IH 組腫瘤組織質量高于RA 組（

Z

=-2.143，

P＜

0.05）。RA 組和IH 組腫瘤組織質量占小鼠體質量的比例分別為2.46%和8.87%，IH 組腫瘤組織質量占小鼠體質量的百分比高于RA 組，兩組相比差異有統(tǒng)計學意義（

Z

=-2.429，

P＜

0.05）。

2.2 腫瘤組織細胞凋亡情況

RA組腫瘤組織切片中相應凋亡小體個數(shù)為（129.75±20.20）個，IH組腫瘤組織切片中凋亡小體個數(shù)為（81.18±8.92）個；IH組腫瘤組織切片中凋亡小體個數(shù)低于RA組（

t

=2.424，

P＜

0.05）。

2.3 Western blotting 檢測Akt、p

-

Akt 在IH 和RA腫瘤組織中的表達

RA 組和IH 組腫瘤組織中Akt的相對表達量分別為（0.79±0.03）、（0.80±0.03），兩組表達量差異無統(tǒng)計學意義（

t

=-0.128，

P＞

0.05）。IH 組腫瘤組織中p-AKT 的相對表達量（0.62±0.02）高于RA組（0.50±0.04）（

t

=-2.604，

P＜

0.05）。見圖1。

2.4 mTOR、p

-

mTOR 在IH 組和RA組腫瘤組織中的表達

RA 組和IH 組腫瘤組織中mTOR 的相對表達量分別為（0.64±0.04）、（0.62±0.06），兩組差異無統(tǒng)計學意義（

t

=0.243，

P＞

0.05）。IH 組中p-mTOR 的相對表達量（0.35±0.02）高于RA 組（0.26±0.03）（

t

=-2.711，

P＜

0.05）。見圖2。

圖1 常氧組（RA）與間歇性缺氧組（IH）Western blotting 檢測Akt、p-Akt及β-actin的表達

圖2 Western blotting檢測mTOR、p-mTOR及β-actin的表達

3 討論

近幾年的研究發(fā)現(xiàn)OSA模式的間歇性缺氧可以促進腫瘤的生長和轉移。2012年西班牙學者Almendros發(fā)現(xiàn)暴露在間歇性環(huán)境2周的小鼠與正常組比較其黑色素實體瘤的體積、質量均增加。Huang也發(fā)現(xiàn)暴露在間歇性環(huán)境5周的小鼠與正常組比較其腫瘤的體積、質量均增加。動物實驗證明OSA 模式間歇低氧不僅與腫瘤發(fā)生有關，且與腫瘤的生長有關。本研究發(fā)現(xiàn)間歇性缺氧環(huán)境暴露2周后，IH組S180腫瘤的質量明顯高于RA組（

P＜

0.05），IH組S180腫瘤質量占小鼠體質量的百分比高于RA組（

P＜

0.05），說明間歇性缺氧可促進實體瘤的生長。腫瘤在生長過程中存在著細胞增殖與凋亡的失衡，細胞凋亡受到抑制會使細胞死亡率下降，將導致細胞數(shù)目不斷增加，表現(xiàn)出生長的優(yōu)勢。因此，我們檢測了腫瘤組織中的細胞凋亡情況，結果發(fā)現(xiàn)IH 組S180 腫瘤組織切片中相應凋亡小體個數(shù)低于RA 組（

P＜

0.05）。說明IH 所致的腫瘤細胞生長加速與IH條件下細胞的凋亡減少有關。mTOR 信號通路與凋亡、炎癥和自噬等多種腫瘤的發(fā)病機制有關。研究表明，胰腺癌、白血病、膀胱癌等腫瘤可通過抑制mTOR活化促進細胞凋亡進程。我們的研究發(fā)現(xiàn)IH 組S180 腫瘤組織切片中凋亡小體個數(shù)低于RA 組（

P＜

0.05）。說明在本實驗條件下，磷酸化mTOR 的激活可能抑制了細胞的凋亡進程，從而促進了腫瘤組織的生長。

mTOR 可被PI3K/Akt 途徑激活?；罨牧字＜〈?-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）可在3-磷酸肌醇依賴蛋白激酶1（3-phosphoinositidedependent protein kinase1，PDK1）的協(xié)同下磷酸化Akt 使其被激活。活化的Akt 磷酸化結節(jié)性腦硬化復合物-2（Tuberous sclerosis complex-2，TSC2），而被磷酸化的TSC2 將從負向調控腦內Ras 同系物（Ras homolog enriched in brain，Rheb）的結節(jié)性腦硬化復合物-1（Tuberous sclerosis complex-1，TSC1）/TSC2 復合物中解聚，使Rheb 活性增強，正向調控mTOR 的活性。磷酸化Akt 的增加，mTOR 也增加，因此，Akt與mTOR 可構成Akt/mTOR 通路，Akt 由480 個氨基酸殘基組成，具有可催化及可調節(jié)活性區(qū)域，該區(qū)域可使Akt 磷酸化成p-Akt 而發(fā)揮各種生理功能。mTOR 是Akt 的下游底物，活化的Akt 可直接激活mTOR 而發(fā)揮調控細胞的周期、生長增殖等作用。大量研究表明，多種實體瘤組織中均有Akt、mTOR 蛋白的異常表達。有研究表明Akt、mTOR 磷酸化水平增加可使腫瘤細胞凋亡減少，在我們的研究中，p-mTOR 上調的同時Akt的磷酸化被激活，說明Akt/mTOR 通路被激活，導致腫瘤細胞凋亡減少，這可能是腫瘤細胞凋亡減少的原因。

Akt／mTOR 信號通路不僅與腫瘤的凋亡有關，還可能與腫瘤的預后關系密切，張剛等發(fā)現(xiàn)宮頸癌、肺癌和胃癌的發(fā)生發(fā)展及預后變差與Akt／mTOR信號通路的激活關系密切。我們的結果表明IH暴露后，S180 實體瘤腫瘤組織Akt/mTOR 通路上調，提示IH可能是OSA 導致實體瘤預后變差的原因之一。

綜上所述，IH 可促進腫瘤的生長，導致缺氧小鼠腫瘤重量增加，其機制可能同Akt-mTOR 通路在腫瘤組織中的激活，減少腫瘤組織凋亡小體的數(shù)量，抑制了腫瘤細胞凋亡有關。