不同咽拭子取樣肺炎支原體DNA檢測對支原體肺炎診斷價值研究

丁彩云，王夢瑾，孫立清

作者單位：蚌埠市第一人民醫(yī)院（蚌埠市兒童醫(yī)院）小兒呼吸內(nèi)科，安徽 蚌埠233000

支原體肺炎也稱為冷凝集陽性肺炎，該病主要由支原體感染所致，據(jù)相關(guān)調(diào)查顯示支原體肺炎占兒童獲得性肺炎的10%～40%，常表現(xiàn)為發(fā)熱及咳嗽，多數(shù)病兒精神狀況良好，無氣促及呼吸困難，在重癥時可出現(xiàn)呼吸困難，甚至引起灶性肺不張、肺實變及肺氣腫。因支原體肺炎與其他肺部感染鑒別難度大，容易出現(xiàn)誤診而延誤治療時機(jī)，目前對于支原體肺炎診斷的金標(biāo)準(zhǔn)仍是支原體培養(yǎng)，該方法培養(yǎng)要求高且耗時較長，在臨床實際實施過程難度較大。因此臨床上多采用血清特異性抗體檢測，目前主要以MP-IgM陽性轉(zhuǎn)化或抗體滴度上升4倍以上則診斷為MP感染，但MP-IgM檢測有一定的滯后性，在發(fā)病1周后才可檢測且假陰性率較高，因而難以實現(xiàn)對支原體肺炎的早期診斷。近期有研究發(fā)現(xiàn)呼吸道分泌物PCR 檢測可用于支原體肺炎的早期診斷，目前關(guān)于咽拭子取樣肺炎支原體DNA檢測對支原體感染性肺炎病兒診斷方面的研究已有相關(guān)報道，但仍存在一定的假陽性與假陰性的結(jié)果，分析原因可能與取樣過程操作有關(guān)。因此本研究旨在通過優(yōu)化咽拭子取樣過程以提高咽拭子取樣肺炎支原體DNA檢測對支原體感染性肺炎病兒診斷效能。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年2月至2019年6月在蚌埠市第一人民醫(yī)院（蚌埠市兒童醫(yī)院）接受治療的疑似肺炎支原體感染住院病兒174 例進(jìn)行研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病兒經(jīng)臨床特征及檢查疑似為支原體肺炎，參照《兒童肺炎支原體肺炎診治專家共識（2015年版）》制定支原體肺炎的疑似表現(xiàn)：以咳嗽、發(fā)熱為主要表現(xiàn)，部分伴有畏寒、頭痛胸悶等癥狀；白細(xì)胞計數(shù)正常或偏低，在重癥病兒中C反應(yīng)蛋白可明顯增高；肺部CT 檢查表現(xiàn)為磨玻璃影、結(jié)節(jié)狀或小斑片狀影，同時可有支氣管壁增厚、支氣管充氣征及支氣管擴(kuò)張等表現(xiàn)；②病兒神志清醒，智力正常，可配合進(jìn)行相關(guān)檢查；③病兒家屬已獲知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①對標(biāo)本采集過程使用藥物過敏者；②不愿意配合進(jìn)行采樣者；③既往支原體感染者；④患有自身免疫缺陷性疾病的病人。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，病兒近親屬對研究方案簽署知情同意書。

1.2 方法

所有病兒入院后均由同一組護(hù)士采用2種咽拭子采集方式對氣道分泌物進(jìn)行采集，采集前要求病兒禁食、禁飲4 h 以上。具體操作如下：（1）常規(guī)采集：直接以無菌咽拭子在病兒喉部迅速捻轉(zhuǎn)一周，提取咽拭子標(biāo)本，加入1.5 mL 滅菌生理鹽水振蕩2～3 次后混勻，吸取1 mL 生理鹽水至離心管中，以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min后棄去上清液，在沉淀中加入50 μL DNA 提取液，在100 ℃恒溫處理10 min 后以12 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，取2 μL 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，采用新加坡生產(chǎn)的ABI7500 型熒光定量PCR儀。試劑盒是中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司、PCR熒光探針法，具體操作按儀器及試劑盒操作說明進(jìn)行。（2）改良咽拭子取樣：對病兒取樣前先以吸入用乙酰半胱氨酸溶液（意大利ZAMBON公司，批準(zhǔn)文號H20150548，批次20190427）3 mL 進(jìn)行霧化10 min，再行咽拭子取樣，取樣方式及檢測方法同常規(guī)采集。（3）金標(biāo)準(zhǔn)：參照諸福棠《實用兒科學(xué)》第7版中對支原體肺炎的相關(guān)診斷，根據(jù)臨床癥狀、胸片及入院次日及入院后7～10 d，抽取病人空腹外周靜脈血3 mL，分別進(jìn)行MP-IgM 檢測，雙份血清抗體滴度檢測呈4倍以上增長則確診為支原體肺炎。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

174 例病兒男89 例，女85 例；年齡范圍1～13歲，年齡（7.53±1.47）歲；病程范圍3～21 d，病程（14.09±4.15）d，其中37例（21.26%）經(jīng)金標(biāo)準(zhǔn)診斷確診為支原體感染性肺炎。

2.2 常規(guī)咽拭子取樣肺炎支原體DNA 檢測對支原體感染性肺炎診斷效能分析

常規(guī)咽拭子取樣肺炎支原體DNA 檢測與金標(biāo)準(zhǔn)診斷結(jié)果一致性尚可（Kappa=0.526，

P＜

0.001），常規(guī)咽拭子取樣肺炎支原體DNA 檢測對支原體感染性肺炎診斷的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為78.38%（29/37）、82.48%（113/137）、81.61%（142/174）、54.72%（29/53）、93.39%（113/121）。

2.3 改良咽拭子取樣肺炎支原體DNA 檢測對支原體感染性肺炎診斷效能分析

改良咽拭子取樣肺炎支原體DNA 檢測與金標(biāo)準(zhǔn)診斷結(jié)果一致性良好（Kappa=0.781，

P

＜0.001），改良咽拭子取樣肺炎支原體DNA 檢測對支原體感染性肺炎診斷的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為94.59%（35/37）、91.24%（125/137）、91.95%（160/174）、74.47%（35/47）、98.43%（125/127）。

2.4 不同咽拭子取樣方式對支原體感染性肺炎診斷效能對比

檢驗結(jié)果表明，改良咽拭子取樣肺炎支原體DNA 檢測對支原體感染性肺炎診斷效能靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值均高于常規(guī)咽拭子取樣（

P

＜0.05）。見表1。

表1 不同咽拭子取樣方式對支原體感染性肺炎診斷效能對比

3 討論

相關(guān)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示每隔5年左右支原體感染性肺炎可出現(xiàn)一次地域性流行，在兒童密集區(qū)流行較為嚴(yán)重，在非流行年間支原體約占小兒肺炎病原的10%～20%，流行年份則高達(dá)30%以上。本研究174例疑似病例中37例（21.26%）經(jīng)金標(biāo)準(zhǔn)診斷確診為支原體感染性肺炎，與上述研究結(jié)果相當(dāng)。肺炎支原體可經(jīng)飛沫傳播而引起兒童呼吸道感染，肺炎支原體感染性肺炎臨床表現(xiàn)不一，病情或輕或重、病程較長、容易反復(fù)發(fā)作，還可引起多種肺外并發(fā)癥，嚴(yán)重者可引起病人死亡。因此對該病早期快速診斷，及時使用大環(huán)內(nèi)脂類抗生素可有效縮短病程，減少并發(fā)癥的發(fā)生。對于該病的診斷傳統(tǒng)以分離培養(yǎng)及抗體檢測為金標(biāo)準(zhǔn)，但抗體檢測需通過2次比較上升4倍以上才可確診，導(dǎo)致診斷出現(xiàn)滯后性而延誤病情，而痰培養(yǎng)結(jié)果判定則更長，需要3～4周的時間，同時還受取樣的影響，假陰性率較高，不利于病人的治療。

近年來PCR技術(shù)在病原體檢測方面得到了廣泛的應(yīng)用，其敏感性高，特異性強(qiáng)的優(yōu)勢是過去其他檢測技術(shù)所無法比擬的，特別是熒光定量PCR技術(shù)的發(fā)展，可通過擴(kuò)增基因片段而對病原體進(jìn)行診斷，該方法操作難度小，敏感度高，可實現(xiàn)對支原體感染性肺炎的早期診斷，但受取樣方式的影響可能導(dǎo)致一定假陰性率的出現(xiàn)。有研究者曾對肺泡灌洗液、咽拭子等幾種取樣方式進(jìn)行分析結(jié)果顯示：肺泡灌洗液取樣檢測方式診斷效能最佳，但該取樣方式需采用纖維支氣管鏡進(jìn)行肺泡灌洗，對病兒有一定的創(chuàng)傷性，加上操作過程中需要病兒的配合，實施難度較大，因此未在臨床上大面積推廣使用。目前臨床仍以咽拭子取樣為主，該取樣方式操作簡便，對病兒無創(chuàng)傷，病兒及其家屬接受程度更高。加上從理論上講，咽部為肺炎支原體最早感染繁殖部位，可在發(fā)病早期采集到病原體。但因支原體感染可致病人咽部分泌物增加且分泌物較為黏稠，在咽拭子取樣時容易因取樣不均而造成假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，因此有必要對常規(guī)的咽拭子取樣方式進(jìn)行改良，以降低因取樣不當(dāng)而引起的假陰性結(jié)果。本研究結(jié)果中兩種取樣方式均與金標(biāo)準(zhǔn)具有較高的一致性，但改良咽拭子取樣方式靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值更高，可有效降低誤診率。乙酰半胱氨酸為臨床上常用的支原體肺炎等呼吸道疾病治療藥物，為半胱氨酸N-乙酰化衍生物，其結(jié)構(gòu)中含有一自由的親核基團(tuán)-巰基（-SH）可使黏痰中的酸性糖蛋白多肽二硫鍵斷裂，而達(dá)到分解黏液蛋白復(fù)合物使痰液黏稠度降低的作用。同時該藥物還可裂解膿痰DNA，使痰液迅速被溶解而加速排出，使咽拭子所取樣品更為均勻，減少膿痰對取樣的影響，使準(zhǔn)確率明顯上升。加上乙酰半胱氨酸抗氧化能力較強(qiáng)，可通過多種途徑參與氮氧化物的抗菌作用，破壞細(xì)菌蛋白鐵硫集群而催化毒性氧化反應(yīng)，同時該藥物提供的一氧化氮還可擾亂參與DNA復(fù)制的鋅蛋白及酪氨酰激酶反應(yīng)而抑制DNA復(fù)制，在提高檢出率的同時還可緩解病情。

綜上所述，咽拭子取樣肺炎支原體DNA 檢測對支原體感染性肺炎病兒具有較高的診斷價值，采取改良咽拭子取樣可有效提高診斷靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度及陽性預(yù)測值。