支氣管哮喘病兒外周血單核細胞中LncRNA MEG3的表達及其與肺功能、免疫功能的相關性研究

李麗英，李海燕，陳海燕

作者單位：安陽市婦幼保健院兒科，河南 安陽455000

支氣管哮喘是臨床常見的一種氣道慢性炎癥性疾病，其發病與遺傳、免疫等因素密切相關，在發病過程中有多種基因或細胞因子參與。長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，LncRNA））是一類轉錄本長度超過200nt 的RNA 分子的RNA，雖然不具備蛋白的編碼功能，但能夠在多層面實現對基因表達的調控。在支氣管哮喘發病過程中，LncRNA能夠通過調節炎癥反應等從而參與支氣管哮喘發生及發展過程。長鏈非編碼RNA母系表達基因3（Long noncoding RNAmaternally expressed gene 3，LncRNA MEG3）具有多樣的生物調節功能，對細胞的凋亡及增殖、淋巴細胞的分化及炎性介質的表達均具有調控作用，并且在惡性腫瘤、免疫系統疾病及心血管疾病的發生及進展過程中具有重要的作用。支氣管哮喘的發病及進展與免疫功能異常、炎性介質的持續釋放關系密切，推測LncRNA MEG3對免疫功能及炎性介質的調節作用可能在支氣管哮喘的發病及進展中發揮作用，但目前LncRNA MEG3在小兒支氣管哮喘的發病及進展中的作用尚未見相關的研究報道。因此本研究檢測支氣管哮喘病兒外周血單核細胞中LncRNAMEG3的表達并分析其與病兒肺功能、免疫功能的相關性，旨在探討LncRNA MEG3在支氣管哮喘發病中的作用及其機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年10月至2018年9月安陽市婦幼保健院收治的支氣管哮喘病兒60例，納入標準：（1）診斷符合中華醫學會兒科學分會呼吸學組2016年發布的《兒童支氣管哮喘診斷和防治指南》診斷標準，（2）支氣管哮喘病兒近期1 周內未服用茶堿、糖皮質激素、支氣管擴張劑等影響肺功能的藥物，（3）病兒近親屬對研究內容知情同意。排除標準：合并先天性心臟病病兒；合并自身免疫性疾病病兒；既往惡性腫瘤病史。病兒入選后按病情分組，根據病兒發作時嚴重程度分為輕度組（輕度持續發作，20 例），中度組（中度持續發作，20例），重度組（重度持續發作，20 例）。同時選取同期體檢的健康兒童40 例作為對照組。各組受試者年齡、性別比較差異無統計學意義（

P＞

0.05），具有可比性。病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

表1 支氣管哮喘病兒60例及健康兒童40例一般資料比較

1.2 肺功能檢測

應用MS-IOS型肺功能檢測儀（德國JAEGER 公司）檢測各組受檢兒童的肺功能指標，主要包括第1 秒用力呼氣容積占預計值百分比（FEV1%），第1 秒用力呼氣容積與用力肺活量比（FEV1/FVC）、最大呼氣峰流速占預計值百分比（PEF%）。

1.3 指標檢測

1.3.1

標本采集 清晨采集各組受檢兒童空腹靜脈血4 mL，血液樣本分為兩部分，一部分血液樣本置于非抗凝試管中，室溫放置2 h，4 ℃條件下1 200 r/min 離心15 min，吸取血清置于-80 ℃超低溫冰箱保存。另一部分血液樣本置于EDTA 抗凝試管中，采用Ficoll 密度梯度離心法提取外周血單核細胞，置于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.3.2

LncRNA MEG3 水平檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（Quantitative Real-time PCR，qRTPCR）檢測單核細胞LncRNAMEG3的表達水平，Trizol（美國Invitogen 公司）法提取單核細胞中的總RNA，Nanodrop2000c 超微量分光光度計檢測RNA 濃度。MEG3 正 向 引 物5’-GGGCTTCTGGAATGAGCATG-3’，反向引物5’-TCTATGCCAG ATCCTGCCTG-3’；GAPDH 正 向 引 物5’-AACGGATTTGGTCGTATTG-3’，反向引物5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’；引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。反轉錄體系（北京天根生化科技有限公司）：RNA 2 μL，10×RT Buffer 2 μL，dNTP 0.4 μL，Multiscripe RT 1 μL，10×Random Primer 2 μL，RNase-Free 雙蒸水補足體系至20 μL；反應條件：25 ℃10 min，37 ℃60 min，95 ℃5 min，4 ℃保存。將總RNA反轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行qRT-PCR擴增，反應體系（北京天根生化科技有限公司）：cDNA 2 μL，Real-Time Master Mix 10 μL，正反向引物各1 μL，RNase-Free 雙蒸水補足體系至20 μL；反應條件：95 ℃2 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min，72 ℃30 s（循環40次），置于ABI 7500型熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）檢測，記錄各組Ct 值，ΔCt（實驗組）=Ct（實驗組目標基因）-Ct（實驗組內參基因），ΔCt（對照組）=Ct（對照組目標基因）-Ct（對照組內參），MEG3以GAPDH為內參，采用2法計算LncRNAMEG3的表達量。

1.3.3

免疫功能指標及炎性介質檢測 應用IMMAGE800全自動特定蛋白分析儀（美國貝克曼庫爾特公司）檢測免疫球蛋白E（IgE）水平；應用全自動血細胞分析儀（北京寶靈曼陽光科技有限公司）檢測嗜酸性粒細胞計數水平；采用酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測血清白細胞介素-4（interleukin-4，IL-4）、白細胞介素-17A（interleukin-17A，IL-17A）、γ干擾素（interferon γ，IFN-γ）、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）水平，檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

2 結果

2.1 各組外周血單核細胞中LncRNA MEG3 的表達

重度組，中度組及輕度組LncRNA MEG3 表達水平高于對照組[（0.30±0.07）、（0.42±0.06）、（0.67±0.10）比（1.01±0.13）］（

P

＜0.05），重 度 組LncRNA MEG3 表達水平高于中度組及輕度組（

P

＜0.05）[（0.30±0.07）比（0.42±0.06）、（0.67±0.10）］，中度組LncRNA MEG3 表 達 水 平 高 于 輕 度 組（

P

＜0.05）[（0.42±0.06）比（0.67±0.10）］，。

2.2 各組受檢者肺功能比較

重度組FEV1，FEV1/FVC及PEF低于中度組、輕度組及對照組（

P

＜0.05），中度組FEV1，FEV1/FVC 及PEF 低于輕度組及對照組（

P

＜0.05），輕度組FEV1，FEV1/FVC及PEF低于對照組（

P

＜0.05）。見表2。

表2 支氣管哮喘病兒60例及健康兒童40例受檢者肺功能比較/±s

2.3 各組受檢者免疫功能指標比較

重度組，中度組及輕度組IgE、嗜酸性粒細胞計數水平、IL-4、IL-17A 水平高于對照組（

P

＜0.05），重度組IgE、嗜酸性粒細胞計數水平、IL-4、IL-17A水平高于中度組及輕度組（

P

＜0.05），中度組IgE、嗜酸性粒細胞計數水平、IL-4、IL-17A水平高于輕度組（

P

＜0.05）。重度組、中度組及輕度組IFN-γ、TGF-β 低于對照組（

P

＜0.05），重度組IFN-γ、TGF-β低于中度組及輕度組（

P

＜0.05），中度組IFN-γ、TGF-β低于輕度組（

P

＜0.05）。見表3。

表3 支氣管哮喘病兒60例及健康兒童40例免疫功能指標比較/±s

2.4 支氣管哮喘病兒LncRNA MEG3表達量與肺功能、免疫功能指標的相關性

采用Pearson相關分析支氣管哮喘病兒MEG3表達量與肺功能的相關性，結果顯示MEG3表達量與FEV1、FEV1/FVC、PEF%呈正相關（

P

＜0.05），采用Pearson 相關分析支氣管哮喘病兒MEG3表達量與免疫功能指標的相關性，結果顯示MEG3表達量與IgE、IL-4、IL-17A呈負相關（

P

＜0.05），而與IFN-γ、TGF-β呈正相關（

P

＜0.05）。見表4。

2.5 多因素綜合分析

--

LncRNA MEG3 表達量與病情嚴重程度、肺功能、免疫功能的關聯影響關系

建立多元線性回歸模型，以觀察組（支氣管哮喘病兒）資料為樣本，以LncRNA MEG3 表達量為應變量，以病情嚴重程度、肺功能（以FEV1/FVC 表征之）、免疫功能（以IgE 表征之）等3 個指標/因素為自變量（說明：樣本量較少，肺功能及免疫功能，按臨床專家建議，僅以代表性指標表征之）。回歸過程采用最優子集法。默認建立

R

極大選擇模型，以進行自變量的選擇和剔除。回歸結果：最優子集即全子集，3 個變量均被保留入回歸方程（P＜0.05）。提示：病情嚴重程度、肺功能、免疫功能與LncRNA MEG3表達量有密切的關聯影響關系。見表5。

3 討論

支氣管哮喘主要臨床表現為氣道慢性炎癥與氣道高反應性，其發生過程與遺傳、表觀遺傳學因素等有關，LncRNA可調控相關基因表達從而參與支氣管哮喘等多種疾病發生過程，還可作為疾病早期篩選的分子標志物。因而本研究積極探尋新型LncRNA并分析其與支氣管哮喘病兒肺功能、免疫功能的相關性，為哮喘的診斷提供新的分子標志物。

LncRNAMEG3是在組織中廣泛表達的非編碼長鏈RNA，雖然不具備蛋白編碼功能，但是其能夠多種途徑實現對轉錄及轉錄后過程進行調控，其最早被發現在惡性腫瘤中低表達，并且其表達降低的程度與腫瘤的侵襲性及進展有關。在近年的研究中發現，LncRNA MEG3對免疫細胞及炎性介質的釋放具有調控作用。如在高糖誘導的視網膜上皮細胞中呈低表達，上調MEG3表達可抑制高糖誘導的視網膜上皮細胞炎癥及細胞凋亡。有報道指出LncRNAMEG3可參與多種炎性疾病發生過程。在本研究中亦發現，支氣管哮喘病兒單核細胞中LncRNAMEG3的表達水平降低，并且其降低的程度與病情相關，病情越重的病兒LncRNAMEG3下降的越明顯，提示在小兒支氣管哮喘的進展中，LncRNAMEG3發揮了調控作用。

支氣管哮喘的發病與多因素有關，其中免疫功能異常及炎性介質的釋放具有重要的作用，在支氣管哮喘的發病過程中，細胞免疫及體液免疫均處于失衡狀態，加之肥大細胞、粒細胞等炎性細胞的聚集及炎性介質的釋放，使氣道處于慢性炎癥狀態，導致氣道的高反應性，在外來抗原的刺激下，誘發氣道的痙攣，導致支氣管哮喘的發作[17］。本研究顯示，IgE、嗜酸性粒細胞計數水平、IL-4、IL-17A 水平顯著升高，IFN-γ、TGF-β 水平顯著降低，呼吸道是IgE 表達的部位之一，由漿細胞產生，能夠誘發Ⅰ型變態反應，誘發支氣管哮喘的發生。在支氣管哮喘的發作過程中，輔助型T 細胞1（Th1）與輔助型T 細胞2（Th2）細胞分泌水平失衡哮喘進展的重要原因[18］。相關報道指出IFN-γ 是Th1 細胞的主要效應細胞因子，IL-4 是Th2 細胞的主要效應細胞因子，IL-17A 是輔助型T細胞17（Th17）的主要效應細胞因子，TGF-β是調節性T細胞（Treg）的主要效應細胞因子，研究表明Th1、Th2、Th17、Treg 細胞介導的免疫反應與多種炎癥性疾病發生及發展過程密切相關[19］。IL-4、IL-17A 及IFN-γ 水平的變化，提示在支氣管哮喘兒童，Th1/Th2 免疫飄逸，導致其下游的炎性介質的表達異常，參與支氣管哮喘的進展。而TGF-β 能夠誘導Th0細胞的分化方向，對其下游的炎性介質進行調控，進而參與支氣管哮喘的發病及進展。

表4 支氣管哮喘60例LncRNA MEG3表達量與肺功能、免疫功能指標的相關性

表5 支氣管哮喘60例病情嚴重程度、肺功能、免疫功能與LncRNA MEG3表達量的多元線性回歸結果

在進一步的研究中發現，在小兒支氣管哮喘病兒，LncRNAMEG3的表達水平與IgE、IL-4、IL-17A呈負相關，而與IFN-γ、TGF-β 呈正相關，與FEV1，FEV1/FVC 及PEF 呈現正相關，病情嚴重程度、肺功能、免疫功能與LncRNA MEG3 表達量有密切的關聯影響關系。提示LncRNAMEG3 能夠反應病兒肺部的功能狀態，其可能通過對免疫因子及炎性介質的釋放的調控而參與支氣管哮喘的發生及進展。

綜上所述，MEG3在支氣管哮喘病兒外周血單核細胞中呈低表達，并可能參與哮喘發生及發展過程，可作為早期診斷哮喘及監控疾病進展的分子標志物，對哮喘病兒預后的預判具有一定作用，其可能通過對免疫因子及炎性介質的調節發揮作用。但LncRNAMEG3在支氣管哮喘發生及發展過程中的作用機制尚未可知，還需擴大樣本量進行分子生物學探究。