微小RNA-21調控同源性磷酸酶-張力蛋白基因表達在子癇前期發病中的作用機制

2021-04-09 08:51:48楊慧麗楊俊娟李新敏

安徽醫藥 2021年4期

楊慧麗，楊俊娟，李新敏

作者單位：鄭州市婦幼保健院，a婦產科，b病理科，河南鄭州450053

子癇前期（preeclampsia，PE）是妊娠期常見并發癥，好發于妊娠20周以后，多表現為血壓升高和尿蛋白等癥狀，但其病因尚不明確，臨床治療僅限于對癥治療、盡量延長孕周，尚無特效療法，我國孕婦發病率達5%～10%，是引起孕產婦和圍生兒死亡的主要原因。目前普遍認為，PE與滋養細胞浸潤過淺導致胎盤淺著床有關，滋養細胞對母體子宮內膜的適當浸潤對維持正常妊娠非常重要，但其調控機制尚不清楚。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類內源性非編碼小RNA，可通過與靶mRNA 3ˊ非編碼區（3ˊ-untranslated region，3ˊUTR）完全或不完全互補結合抑制其轉錄后表達，與細胞增殖、分化和凋亡等生物學活性有關，最新研究表明，miRNA 與PE 發生發展關系密切，有望成為其新型診斷標志物及治療靶點。miR-21是一種癌基因，與多種腫瘤細胞侵襲、轉移等有關，與PE的關系及對滋養細胞的影響少有研究。滋養細胞浸潤母體子宮內膜機制與腫瘤侵襲、轉移很相似，因此本研究擬探究miR-21 表達與PE的關系及對人絨毛膜滋養層細胞HTR-8/SVneo細胞侵襲、凋亡的影響，并初步探究其可能調控機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年8月至2019年10月鄭州市婦幼保健院收治的45 例PE 病人（PE 組）及45 例匹配正常孕婦（正常組）剖宮產手術中獲得的胎盤組織。PE 病人年齡范圍22～35 歲，年齡（28.02±3.15）歲，孕周（34.26±2.49）周，其中輕度PE 31 例、中度PE 12 例和重度PE 2 例。正常組孕婦年齡范圍21～35 歲，年齡（26.92±3.47）歲，孕周（35.13±3.11）周，兩組孕婦年齡、孕周等一般資料比較，差異無統計學意義（

=1.575、1.465，

=0.119、0.147），具有可比性。本研究經鄭州市婦幼保健院倫理委員會批準通過（審批文號2016-〔S〕08），所有樣品采集及資料調查均取得病人及其家屬知情同意并簽署知情同意書，符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》。

1.2 細胞、試劑及儀器

人絨毛膜外滋養層細胞（HTR-8/SVneo）細胞（上海康朗生物科技有限公司，貨號kl-CC337655）；RPM 11640 培養基（美國Gibco公司，貨號21870084）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，美國Gibco 公司，貨號10099141）；AnnexinVFITC 凋亡檢測試劑盒（美國Sigma 公司，貨號APOAF）；含miR-21種子序列的PTEN 3ˊUTR 野生型重組質粒（pmirGLO-PTEN-Wt）及突變型重組質粒（pmirGLO-PTEN-Mut）由廣州銳博生物科技公司合成；Lipofectamine2000 轉染試劑盒（貨號11668）、miRNA 提取試劑盒（貨號：AM1561）購自美國Invitrogen 公司；microRNA 定量試劑盒（貨號638315）、TB GreenPremix Ex Taq?Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（貨號RR820A）購自TaKaRa 公司；一抗兔源anti-PTEN抗體（貨號ab32199）、anti-p-PI3K（貨號ab32089）、anti-p-AKT（貨號ab38449）、anti-GAPDH 抗體（貨號ab9485）、羊抗兔anti-IgG（貨號ab205718）均購自英國Abcam 公司；引物、miR-21 模擬物（mimics）、抑制物（inhibitor）及無意義序列（scramble）由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（貨號E1920）購自美國Promega公司等。

Evolution 220 紫外分光光度計、FC 型酶標儀、Forma Steri-Cycle i160 5%二氧化碳培養箱購自美國Thermo Fisher 公司；倒置熒光顯微鏡ix53 購自日本Olympus 公司；羅氏LightCycler96 實時熒光定量PCR 儀購自Roche 公司；CytoFLEX 流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司等。

1.3 方法

1.3.1

細胞培養及分組 HTR-8/SVneo 細胞常規復蘇后采用含5%FBS、1%青鏈霉素的RPM 11640 培養基置于37 ℃、飽和濕度、5%二氧化碳培養箱培養。細胞傳代時用0.25%胰蛋白酶消化。

1.3.2

細胞轉染取對數期生長HTR-8/SVneo 細胞，消化計數后以5×10個/孔接種于6 孔細胞板，轉染前1 d 更換為不含青鏈霉素的培養基孵育，采用脂質體2000 轉染法將miR-21 mimics（mimics 組）、miR-21 inhibitor（inhibitor 組）及scramble（NC 組）序列分別轉染至HTR-8/SVneo 細胞，另設無任何處理HTR-8/SVneo 細胞為空白對照組（BC 組），每組6 個復孔。轉染后4～6 h 更換新鮮培養基，培養48 h 后收集細胞進行后續實驗。

1.3.3

RT-qPCR miRNA 提取試劑盒提取PE 病人及正常胎盤組織、各組HTR-8/SVneo 細胞總RNA，紫外分光光度計檢測其濃度及純度，反轉錄的cDNA，-20 ℃保存備用。實時定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）法擴增miR-21、PTEN mRNA 表達。miR-21 正向引物序列（5’→3’）為GTGCAGGGTCCGAGGT，反向引物序列（5’→3’）為GCCGCTAGCTTATCGACTACG。內參U6 正向引物序列（5’→3’）為CTCGCTTCGGCAGCACA，反向引物序列（5’→3’）為AACGCTTCACGAATTTGCGT。PTEN 正向引物序列（5’→3’）為CCGAAAGGTTTTGCTACCATTCT，反向引物序列（5’→3’）為AAAATTATTTCCTTTCTGAGCATTCC 。內參GAPDH 正向引物序列（5’→3’）為AGAAGGCTGGGGCTCATTTG，反向引物序列（5’→3’）為AGGGGCCATCCACAGTCTTC。反應條件：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，34 s，40 個循環。2法分析miR-21 及PTEN mRNA相對表達水平。

1.3.4

WB 實驗參照蛋白提取試劑盒操作說明提取PE 病人及正常胎盤組織、1.3.2 中四組細胞總蛋白，測定蛋白濃度后，置于-80 ℃冰箱保存備用。取50μg 蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，室溫封閉，添加一抗（PTEN 1∶1 000；p-PI3K 1∶500；p-Akt 1∶1 000；GAPDH 抗體1∶500）4 ℃孵育過夜，TBST 緩沖液洗膜，添加二抗IgG（1∶5 000）室溫孵育1 h，按上述方法洗膜，之后依次顯色，曝片，以GAPDH為內參，觀察并分析蛋白條帶灰度值。

1.3.5 Tanswell

侵襲實驗將對數期生長細胞鋪板Tanswell小室，轉染及分組同1.3.2，轉染4 h后消化重懸細胞，以1×10/小室接再次種于上述Tanswell小室，添加培養基100 μL，24 h后乙醇固定、結晶紫染色，清洗，拍照，顯微鏡下隨機選取5個視野進行計數求其平均值。

1.3.6

細胞凋亡檢測將1.3.2 中四組細胞制成1×10/mL 單細胞懸液，參照AnnexinV-FITC 凋亡檢測試劑盒說明書，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.3.7

雙熒光素酶報告基因實驗采用TargetScan 7.1（http：//www. targetscan. org/vert_71/）軟件及miRTarBase軟件（http：//mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php）預測人miR-21 的潛在靶基因及靶向結合種子序列位點。采用脂質體2000 轉染法將miR-21 mimics+ pmirGLO-PTEN-Wt （mimics+Wt組）、scramble+ pmirGLO-PTEN-Wt（NC+ Wt 組）、miR-21 mimics+ pmirGLO-PTEN-Mut（mimics + Mut組）、scramble + pmirGLO-PTEN-Mut（NC+Mut 組）分別共轉染至對數期生長HTR-8/SVneo 細胞，每組6個復孔。培養48 h 后，收集各組細胞，采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定各組細胞相對熒光信號強度，具體步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 miR

21 及PTEN 在PE 病人及正常胎盤組織中表達情況比較

以正常胎盤組織中miR-21、PTEN mRNA 表達水平為1，PTEN 蛋白表達水平為（0.45±0.06），PE胎盤組織中miR-21（0.41±0.05）表達水平顯著降低（

=79.157，

=0.000），PTEN mRNA（4.13±0.58）及蛋白（0.91±0.08）表達水平均顯著增加（

=36.201、30.858，

=0.000、0.000）。PE胎盤組織中miR-21與PTEN表達水平呈負相關（

=-0.542，

＜0.05）。

2.2 miR

21對HTR

8/SVneo細胞侵襲的影響

BC組、NC組、mimics組和inhibitor組HTR-8/SVneo細胞侵襲個數分別為200.08±19.87、198.57±19.49、325.38±36.74、85.27±10.13，與BC、NC 組比較，mimics 組侵襲細胞數顯著增加（

=13.01、13.16，

=0.00、0.00），inhibitor 組侵襲細胞數顯著減少（

=11.92、11.76，

=0.00、0.00），均差異有統計學意義（

=103.70，

=0.00）。

2.3 miR

21對HTR

8/SVneo細胞凋亡的影響

結果見圖1。BC組、NC組、mimics組和inhibitor組HTR-8/SVneo 細胞凋亡率分別為16.24±2.11、17.67±2.23、9.29±1.35、41.48±3.07，與BC組、NC組比較，mimics組凋亡率顯著降低（

=7.49、9.03，

=0.00、0.00），inhibitor組凋亡率顯著增加（

=27.20、25.65，

=0.00、0.00），均差異有統計學意義（

=228.40，

=0.00）。

2.4 miR

21 靶基因生物信息學分析

miRTarBase軟件預測miR-21 與PTEN3ˊUTR 區存在靶向結合位點。見圖2。

2.5 雙熒光素酶報告基因實驗

以轉染NC+Wt相對熒光活性值為1，即（1.00±0.00），轉染mimics+Wt 后HTR-8/SVneo細胞相對熒光活性（0.39±0.04）顯著降低（

=37.355，

=0.000）。以轉染NC+Mut相對熒光活性值為1，轉染mimics+Mut后HTR-8/SVneo細胞相對熒光活性為（1.03±0.12），差異無統計學意義（

=0.612，

=0.554）。

2.6 miR

21 對HTR

8/SVneo 細胞PTEN、p

PI3K、p

Akt 蛋白表達的影響

與BC、NC 組比較，mimics組PTEN 表達水平顯著降低（

=8.71、9.33，

=0.00、0.00），p-PI3K、p-Akt 蛋白表達水平顯著增加（

=15.03、15.70、17.66、16.91，

=0.00、0.00、0.00、0.00），inhibitor 組PTEN 蛋白表達水平顯著增加（

=20.53、19.91，

=0.00、0.00），p-PI3K、p-Akt 蛋白表達水平顯著降低（

=12.70、12.03、7.51、8.27，

=0.00、0.00、0.00、0.00）。見表1、圖3。

圖1 凋亡流式術檢測miR-21對HTR-8/SVneo細胞凋亡的影響：A為BC組；B為NC組；C為Mimics組；D為Inhibitor組

圖2 miR-21與PTEN 3ˊUTR區的靶向結合位點

3 討論

研究表明，多種miRNAs與PE發生發展有關。Schlosser等研究報道，循環miR-206和Wnt信號與女性PE病史及預后心血管疾病有關。Xie等研究報道，miR-320a上調通過靶向白細胞介素4抑制滋養細胞生長和侵襲，促進PE發生。Dong等研究報道，與對照組比較，晚發性PE病人循環中miR-21表達水平下調，有望成為晚發性PE的診斷標志。本研究結果發現，與正常組比較，PE組病人胎盤組織中miR-21表達水平顯著降低，與其在癌癥中表達趨勢相反，可能與疾病異質性有關，提示miR-21與PE發生有關。

PTEN 即第10號染色體缺失性磷酸酶和張力蛋白同源物基因，是一個經典抑癌基因，其表達產物PTEN 蛋白同時具有磷脂酸酶和蛋白磷酸酶活性，在細胞生長發育、增殖凋亡、遷移、侵襲、信號傳遞等方面起重要調控作用，與PE 發生發展密切相關。Wu 等研究報道，PE 病人中PTEN 顯著上調，過表達長鏈非編碼RNA TCL6 可抑制滋養細胞增殖促進PE 發展，與靶向抑制PTEN 表達有關。Xue 等研究報道，PTEN 表達增加可通過調控AP-1 NF-κB 通路導致HTR-8/SVneo 細胞侵襲能力降低，促進PE 發展。薛平平等研究報道，過表達PTEN 可通過抑制PI3K/Akt 通路激活下調基質金屬蛋白MMP-2、MMP-9 等表達抑制細胞遷移和侵襲，影響絨毛外滋養細胞侵入，促進PE發生。本研究結果發現，與正常組比較，PE組孕婦胎盤組織中PTEN顯著增加，與miR-21呈負相關。且本研究通過雙熒光素酶報告基因實驗驗證結果顯示，與轉染NC+Wt比較，轉染mimics+Wt 后HTR-8/SVneo 細胞相對熒光活性顯著降低，提示PTEN 是miR-21 下游靶向調控基因，PE發生可能二者表達水平異常有關。

miR-21 靶基因繁多，調控通路復雜，其中miR-21 靶向PTEN 調控PTEN/PI3K/Akt 通路影響腫瘤細胞增殖、凋亡等生物學活性相關研究屢見不鮮，但關于miR-21 靶向PTEN 對HTR-8/SVneo 細胞的研究尚鮮有。王輝等研究報道，AS-miR-21 通過負調控PTEN/PI3K/Akt 信號通路抑制非小細胞肺癌A549 細胞增殖、遷移。李欣然等研究報道，上調miR-21 可靶向抑制PTEN、PDCD4 基因表達對化療誘導卵巢早衰大鼠具有顯著治療作用。本研究結果發現，與BC 組、NC 組比較，mimics 組HTR-8/SVneo細胞侵襲細胞數、p-PI3K、p-Akt蛋白表達水平顯著增加，凋亡率、PTEN 蛋白表達水平顯著降低，inhibitor 組呈相反趨勢，提示過表達miR-21 可促進TR-8/SVneo 細胞侵襲，抑制其凋亡，可能與下調PTEN 蛋白表達激活PI3K/Akt 通路有關，抑制miR-21則呈相反趨勢可再次印證以上結果。

表1 HTR-8/SVneo細胞PTEN、p-PI3K、p-Akt蛋白表達比較/±s

圖3 HTR-8/SVneo細胞中PTEN、p-PI3K、p-Akt蛋白表達WB檢測結果

綜上所述，miR-21 在PE 病人胎盤組織中低表達，過表達miR-21 可通過靶向抑制PTEN 表達促進細胞侵襲并抑制其凋亡，可能與促進PI3K/Akt 通路激活有關，敲低miR-21 表達與之結果相反，可能對臨床PE 發病機制及治療提供新的靶點。本研究尚存在不足之處，miR-21 靶點基因繁多，是否有其他靶基因與PTEN 共同參與PE 發生及TR-8/SVneo 細胞侵襲，尚不清楚，有待進一步深入探究。