抗菌肽GH12對齲相關三菌種生物膜形貌及菌種構成的影響

李欣蔚 王雨霏 姜文韜 張凌琳

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫學研究中心四川大學華西口腔醫院牙體牙髓病科，成都610041

齲病是在牙菌斑、宿主、食物、時間等四聯因素影響下，牙體硬組織發生的慢性進行性破壞的疾病。牙菌斑是三維結構的細菌群落，包括微生物、多糖、蛋白質和DNA[1]，構成牙菌斑的微生物包括致齲菌和共生菌，其群落內部有著復雜的共生和競爭關系。其中變異鏈球菌（Streptococcus mutans，S.mutans）是公認的主要致齲菌之一，其毒力因子包括產酸性、耐酸性以及維持生物膜結構穩定的能力[2]。血鏈球菌（Streptococcus sanguinis，S. sanguinis）和格氏鏈球菌（Streptococcus gordonii，S.gordonii）因產堿和產生H2O2等原因拮抗S. mutans[3]，一般與齲發生率降低密切相關[4-5]。因此，抑制牙菌斑內S. mutans的生長，減少S. mutans生物量和占比，破壞生物膜的結構與形貌的完整性是降低其致齲性的有效途徑。

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）擁有快速殺菌作用和多種殺菌機制，能夠有效地抑制浮游菌生長和生物膜形成，并且已經有研究[6]證實其與口腔健康密切相關。目前，已經有大量關于天然或合成AMPs對致齲菌效果的研究[7-9]。本課題組在前期自主設計并且成功合成了一種抗菌肽GH12，已經證實GH12 無明顯細胞毒性，在唾液中能夠保持良好的穩定性，且具有優越的抗菌性能[10-11]，抑制S.mutans的多種毒力因子，減少胞外多糖（extracellular polysaccharides，EPS） 合成，抑制生物膜形成[12]，還能清除已形成的S. mutans生物膜[10]。

然而，這些研究僅僅關注了GH12對S.mutans的浮游菌和單菌種生物膜的作用，尚需要進一步研究GH12能否對多菌種生物膜內部的S.mutans發揮殺傷作用，并由此改變生物膜的形貌及菌種構成，使得生物膜向更易清除的方向轉化。綜上，本研究擬通過結晶紫染色、掃描電鏡（scanning electron microscopy，SEM）和熒光原位雜交（flu‐orescent in situ hybridization，FISH）的方法探究GH12 能否改變齲相關三菌種生物膜的形貌及菌種構成，并通過選擇性計數法探究GH12 能否降低S.mutans的比例。

1 材料和方法

1.1 多肽合成和試劑

多肽GH12的序列為谷氨酸-亮氨酸-亮氨酸-色氨酸-組氨酸-亮氨酸-亮氨酸-組氨酸-組氨酸-亮氨酸-亮氨酸-組氨酸。GH12 由吉爾生化有限公司（中國）進行合成、鑒別并純化至98%，溶解于無菌去離子水中，冷凍于-20 ℃。除特別說明外，所有試劑均購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 細菌與生物膜培養

S.mutansATCC 700610，S.gordoniiATCC 35105以及S.sanguinisJCM 5708 由四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室提供。在培養生物膜前，挑取具有典型形態的單菌落接種于腦心浸液（brainheart infusion broth，BHI）培養基中，在37 ℃厭氧環境（85%N2，10%H2和5%CO2）下增菌24 h。

齲相關三菌種生物膜模型的建立方法如前所述[13]。3 種細菌懸濁液1∶1∶1 加入BHIS（含1%蔗糖的BHI）培養基中，構成混合菌液備用。將1 mL 混合菌液與不同濃度梯度的GH12 溶液加入24 孔板內，調整細菌終濃度均為1×106CFU·mL-1，GH12 終濃度分別為2、4、8 mg·L-1，對照組不含GH12。將24 孔板置于37 ℃厭氧環境下培養24 h及48 h。每24 h更換一次培養基。

1.3 生物膜形成抑制實驗

將1 mL 混合菌液與不同濃度梯度的GH12 溶液加入24 孔板內，24 h 及48 h 后，吸去上清，PBS 緩沖液漂洗去除浮游菌，甲醇固定15 min，0.1%結晶紫染色5 min，去除多余染料后，使用無水乙醇重溶結晶紫，測595 nm 處的光密度（opti‐cal density，OD）值[10]。

1.4 SEM觀察

PBS緩沖液洗滌生物膜，2.5%戊二醛固定2 h，乙醇梯度脫水（35%、50%、75%、90%、100%，各30 min）[14]。臨界點干燥，噴金鍍膜，在SEM 下觀察生物膜。

1.5 FISH

FISH 熒光探針見表1[13,15]。將培養24 h 和48 h生物膜的玻片置于4%多聚甲醛中過夜，無菌水漂洗后在46 ℃下干燥。加入0.5 mL 含有30 mg·mL-1溶菌酶的裂解緩沖液（50 mmol·L-1乙二胺四乙酸，100 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0）。37 ℃孵育20 min后，漂洗樣本，依次用50%、80%和100%濃度的乙醇連續脫水3 min。在46 ℃下干燥10 min 后，樣本在50 μL、pH 8.0的含有2 nmol·L-1特異探針的雜交緩沖液（20 mmol·L-1Tris-HCl，0.9 mol·L-1Na‐Cl，20%甲酰胺，0.01%十二烷基硫酸鈉） 中46 ℃下避光孵育90 min。48 ℃下用pH 8.0 的預熱洗滌緩沖液（20 mmol·L-1Tris-HCl，5 mmol·L-1乙二胺四乙酸，215 mmol·L-1NaCl，0.01%十二烷基硫酸鈉）將樣本潤洗15 min，再用無核酸酶水漂洗。激光共聚焦掃描顯微鏡（confocal laser scan‐ning microscope，CLSM）采用×100油鏡對生物膜進行觀察。

表1 FISH特異性熒光探針Tab 1 Specific fluorescent probes used in FISH

1.6 S.mutans的選擇性計數

PBS 潤洗后，用1 mL PBS 緩沖液收集入生物膜EP 管中，超聲振蕩分散均勻，10 倍梯度稀釋后，分別接種至BHI 瓊脂平板及輕型唾液鏈球菌-桿菌肽瓊脂（mitis salivarius with bacitracin agar，MSB）平板內。37 ℃厭氧培養48 h 后，進行菌落計數及菌落形成單位（colony-forming units，CFU）計算。根據CFU 計數計算出MSB 平板上生長的菌落數與BHI 平板上菌落數的比值，即為S. mutans在齲相關三菌種生物膜中的比例。

1.7 統計學分析

采用SPSS 20.0 軟件進行統計學分析，采用單因素方差分析（ANOVA）和Tukey HSD 試驗比較組間差異。顯著性水平α為0.05。

2 結果

2.1 結晶紫染色結果

結晶紫染色結果見圖1。GH12 處理后24 h，生物膜OD 值明顯降低，說明生物膜形成量下降。48 h 生物膜在GH12 處理后，OD 值同樣呈下降趨勢，但需要更高濃度GH12（4、8 mg·L-1）處理，形成量才有明顯變化。

圖1 GH12處理后齲相關三菌種生物膜的結晶紫染色結果Fig 1 Crystal violet staining of cariogenic three-species biofilm treated by GH12

2.2 SEM觀察結果

SEM 觀察顯示，對照組24 h 生物膜層次多，密度高，結構緊湊；經不同濃度GH12處理后的生物膜立體形貌崩解，密度逐漸變低，結構越發松散；8 mg·L-1GH12 處理后不能形成生物膜。48 h生物膜結構和形貌變化趨勢與24 h 生物膜基本相同，但變化更加明顯（圖2）。

2.3 FISH

為進一步觀察GH12對齲相關三菌種生物膜形貌及菌種構成的影響，采用FISH 對其進行了研究。如圖3、4 所示，與24 h 生物膜相比，48 h 生物膜的生物量更多，密度更高，結構更緊湊。與對照組相比，經4 mg·L-1和8 mg·L-1GH12 處理的生物膜失去了典型的三維立體結構，并且密度更小，更加疏松。在菌種構成的定性分析方面，隨著GH12 濃度的增加，在24 h 生物膜中，S.mutans的數量逐漸減少，而S.sanguinis和S.gordonii卻保持著相當的生物量。當GH12 濃度為8 mg·L-1時，生物膜中的S. mutans幾乎被完全消除，S. sanguinis含量也有所降低，S.gordonii成為主要菌種構成（圖3）。在48 h生物膜中，S.mutans數量同樣呈下降趨勢，其余兩種細菌比例也逐漸上升。由此可知，齲相關三菌種生物膜的菌種構成發生了變化，GH12 對S. mutans有明顯選擇抑制作用，繼而S.sanguinis和S.gordonii逐漸占據主導地位（圖4）。

2.4 CFU計數

S.mutans的選擇性計數可以定量比較S.mutans所占比例的變化。隨著培養時間的延長，對照組生物膜中S. mutans的占比也略有下降，不同濃度的GH12可不同程度地降低S.mutans的占比（表2）。經GH12處理，24 h生物膜中的S.mutans生物量和占比都隨著GH12的濃度增加顯著減少；經8 mg·L-1GH12 處理后，S.mutans無法檢出。48 h 生物膜表現出相同的變化趨勢，只是變化程度更劇烈。

圖2 GH12處理后齲相關三菌種生物膜SEM圖像Fig 2 SEM images of cariogenic three-species biofilm after GH12 treatment

3 討論

隨著對致齲菌和共生菌之間動態平衡了解的逐漸深入，調節牙菌斑的形成，抑制致齲菌的生長是生態防齲策略的要求之一[16]。S. mutans產生的EPS 為細菌提供了吸附位點，并作為支撐細菌空間分布的基質[17]，有助于細菌的黏附以及生物膜的形成與結構完整性。完整的生物膜為產酸耐酸細菌提供了安全的避難所，確保持續的局部酸性生產，使pH 降低進而導致牙面脫礦[18]。因此破壞生物膜的完整性可降低生物膜的致齲能力。

本研究中，結晶紫染色提示GH12處理后齲相關三菌種生物膜形成量下降，完整性明顯降低。48 h生物膜雖然形成量高于24 h，但同樣呈下降趨勢。然而隨著培養時間延長，2 mg·L-1GH12 處理后的48 h 生物膜與對照組差異無統計學意義，前期實驗發現2 mg·L-1GH12 僅能抑制部分S.mutans毒力因子和相關基因與該現象有關[12]。

生物膜形貌和結構的變化來源于其菌種構成的變化。FISH 和S.mutans選擇性計數的結果均顯示GH12處理后的齲相關三菌種生物膜中S.mutans占比明顯降低。GH12 對S. mutans有顯著抑制作用，但對S. sanguinis和S. gordonii的抑菌作用較弱，后者細菌數量和比例保持了相當高的水平。因此，GH12 可通過選擇性抑制生物膜中S.mutans的生長，進而改變其菌種構成，降低其致齲性。值得注意的是，8 mg·L-1GH12 處理后，生物膜中的S.gordonii占絕對的種群優勢。前期研究發現S.sanguinis對GH12 的敏感性高于S. gordonii[10]，而且S. gordonii在定植位點的種間競爭中占有優勢，甚至可輕微抑制S.sanguinis[19]。因此，在S.mutans被GH12 全面抑制或清除的微生態中，S. gordonii的競爭力比S.sanguinis更強，故占據了種群優勢。

圖3 GH12處理24 h后齲相關三菌種生物膜FISH圖像 CLSM ×100Fig 3 FISH images of 24 h cariogenic three-species biofilm after GH12 treatment CLSM ×100

本研究采用培養法計算生物膜中S. mutans的占比，其基礎是改良MSB 培養基的選擇性培養特性。改良MSB 培養基是一種分離S.mutans最佳的選擇性培養基，能抑制遠緣鏈球菌的生長，S.mutans在該培養基上形成有鑒別意義的深藍色“霜玻璃”樣菌落[20]。培養法僅計數活菌數量，因此可以比較真實地反映生物膜中存活的S. mutans。然而FISH 觀察發現48 h 三菌種生物膜綠色染色更致密。FISH 利用熒光寡核酸探針，靶向結合細菌的16s rRNA[21]，死活菌均可被探針標記，因此反映的是生物膜中各菌的總生物量。隨著培養時間延長，胞外基質會累積，死活菌的代謝更久，因此48 h生物膜染色實驗的總量均會高于24 h。實時定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）也可估算生物膜中S. mutans的含量，這種方法需要首先提取細菌的DNA作為模板，使用qPCR 獲得各種模板擴增至特定熒光值所需的循環數（Ct 值），再通過Ct 值與CFU的標準曲線獲得各菌種的數目[22]。與FISH 類似，qPCR 由于無差別提取生物膜中存在的所有DNA，包括死亡細菌的DNA，所以在描述生物膜中存活的S.mutans的比例上可能存在一定偏差。

圖4 GH12處理48 h后齲相關三菌種生物膜FISH圖像 CLSM ×100Fig 4 FISH images of 48 h cariogenic three-species biofilm after GH12 treatment CLSM ×100

綜上所述，本研究證實了抗菌肽GH12能改變齲相關三菌種生物膜的結構和形貌，并有效降低生物膜中S. mutans的占比，調控生物膜的種群關系。但還需要對GH12對天然牙菌斑的調控和防齲效果等進行進一步的研究，為GH12投入臨床防齲提供更豐富的實驗依據。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。