環維黃楊星D調控Ca2+/CaMK Ⅱ信號改善醛固酮誘導心肌細胞損傷的實驗研究

張光瓊，王聲全，付凌云，徐旖旎，羅 紅，陶 玲，沈祥春，李 玲

(貴州醫科大學 1. 省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，2. 貴州省特色天然藥物高效利用工程中心 藥學院，貴州 貴陽 550025)

心力衰竭是導致心血管系統疾病死亡和心功能惡化的關鍵病理因素，其主要病理變化有三個顯著特征：心肌細胞凋亡和丟失、心肌細胞肥大和心肌纖維化[1]，因此，心肌細胞對維持心臟功能穩態至關重要。心肌細胞是一種終末分化的細胞，其數量與質量是心臟泵血的關鍵，其損傷是多種病理生理因素共同作用的結果，并參與眾多心血管系統疾病的病理進程[2]。醛固酮(aldosterone，ALD)是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)中Ang Ⅱ下游直接激活因子。心臟是ALD直接作用的靶器官之一，據研究報道，ALD介導的心肌細胞損傷主要與促進細胞鈣離子內流增加、線粒體功能障礙及氧化應激等途徑相關[3]，但其進一步的調控機制并未得到深入的研究。因此，明確ALD介導心肌細胞損傷的具體病理新機制，對臨床防治心血管系統疾病和尋找藥物新靶點具有重要的意義。

鈣離子(Ca2+)作為細胞內的第二信使，參與心肌興奮收縮偶聯，Ca2+平衡紊亂可通過誘發心肌缺血再灌注損傷進而導致心肌細胞凋亡[4]。鈣調蛋白激酶Ⅱ(CaMK Ⅱ)是一種多功能的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，研究報道，CaMK Ⅱ在心臟中具有有害作用，胞內Ca2+增加會結合鈣傳感器鈣調素，促進CaMK Ⅱ的磷酸化，進而導致心肌細胞損傷和凋亡[5-6]。此外，CaMK Ⅱ 小分子抑制劑KN93不僅可以保護心肌細胞免受凋亡的影響，還可抑制心肌I/R損傷后的壞死[7]。有趣的是，研究報道ALD通過激活CaMK Ⅱ介導腎集合管細胞纖維化[8]，然而，ALD介導的心肌細胞損傷是否與CaMK Ⅱ 相關尚未見研究報道。因此，本文提出Ca2+/CaMK Ⅱ信號可能是ALD介導心肌細胞損傷的關鍵分子。

環維黃楊星D(cyclovirobuxine D，CVB-D)是從黃楊科黃楊屬植物小葉黃楊(BuxusmicrophyllaSieb.et Zucc. Var.Sinica Rehd.et Wils) 及其同屬植物的莖枝中提取的一種孕甾烷類生物堿。CVB-D對心血管系統疾病具有良好的藥理作用，可改善心肌肥厚、抑制心肌細胞凋亡和損傷等[9-10]。此外，CVB-D可改善ALD介導的原代心肌細胞氧化損傷[4]。基于此，本研究以ALD制備心肌細胞損傷模型為研究基礎，Ca2+/CaMK Ⅱ信號為切入點，探討CVB-D改善ALD誘導PNRCMs損傷的分子機制，以期為CVB-D防治心血管系統疾病提供新的治療靶點，為傳統中藥的開發利用提供理論依據。

1 材料

1.1 實驗動物健康的1～3 d的Sprague Dawley(SD) 乳鼠，雌雄不拘。由貴州醫科大學動物實驗中心提供，生產許可證號：SYXK(黔)2018-0001.

1.2 試劑環維黃楊星D(純度>98% ，成都普思生物科技股份有限公司，860-79 -7)；螺內酯(純度>99%，上海江萊生物科技有限公司，52-01-7)；醛固酮(#MKBX 5094V)、噻唑藍(911L051)和5-溴脫氧尿嘧啶(HMBF4669V)購于美國sigma公司；DMEM 粉(美國Gibco公司，1717154)；吉姆薩染色試劑盒(珠海貝索生物有限公司，416071)；Fluo-4AM鈣離子熒光探針(中國江蘇 Beyotime 公司，S1060)；CaMK Ⅱ(#4436)和p-CaMK Ⅱ(#12716)抗體購于Cell Signaling Technology 公司；Bcl-2(12789-1AP)、Bax(60267-1)和GAPDH抗體(60004-1)購于Proteintech 公司；Cleaved caspase-9抗體(美國Affinity公司，AF5244)。

1.3 儀器DMil倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司)；ChemiDoc XRS+型凝膠成像系統，170-3930型垂直電泳系統(美國Bio-Rad公司)；VARIOSKANLUX 多功能酶標儀(美國 Thermo Fisher Scientific 公司)。

2 方法

2.1 原代心肌細胞的提取、培養及鑒定取1～3 d SD乳鼠，麻醉后75% 的酒精消毒剪取心臟組織，用預冷的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗，再用雙抗(青鏈霉素混合液)漂洗30 s，PBS洗凈雙抗，將心臟剪成約1 mm3大小的組織塊，加入0.125%的胰酶消化液置于4 ℃過夜。次日，加入0.08%的胰酶于37 ℃、5% CO2的培養箱中孵育5 min。用膠頭滴管輕輕吹打組織，將上清吸出加到等體積 DMEM(10% FBS)培養基中終止消化，重復以上操作直至組織成白色半透明狀。將細胞懸液離心(1 000 r·min-1，5 min)，棄上清，加入DMEM(10% FBS)重懸，并接種到培養瓶中，差速貼壁90 min，純化和分離原代心肌細胞。貼壁結束后取細胞懸液，臺盼藍染色計數，并按所需密度接種于所需孔板中，同時加入終濃度為0.1 mmol·L-1的5-溴脫氧尿嘧啶(5-bromo-2-deoxyuridine，5-Br)共培養抑制非心肌細胞增殖，細胞培養72 h后，通過免疫熒光檢測心肌細胞特異蛋白cTnT鑒定心肌細胞及純度。純度達到90% 以上方可用于后續實驗。動物福利和實驗過程均遵循貴州醫科大學動物倫理委員會的規定。

2.2 藥物處理及分組

2.2.1心肌細胞預處理 將細胞按所需密度接種于培養板中，培養至72 h后進行給藥處理。分別采用CVB-D和Spir.預處理細胞2 h，隨后與ALD共同孵育48 h并進行各項指標的檢測。

2.2.2CVB-D對ALD誘導心肌損傷的保護作用 實驗分組為: 對照組(Control)，ALD組(10 μmol·L-1)，CVB-D低劑量組(CVB-D.L，10 μmol·L-1ALD+0.1 μmol·L-1CVB-D)，CVB-D高劑量組(CVB-D.H，10 μmol·L-1ALD+1 μmol·L-1CVB-D)，陽性藥螺內酯(Spir. ，10 μmol·L-1ALD+1 μmol·L-1Spir.)。

2.2.3CVB-D對ALD誘導心肌損傷保護作用機制研究 主要通過給予BAPTA-AM、A23187、KN93干預處理后分析CVB-D改善ALD誘導心肌損傷的作用機制。① 給予BAPTA-AM干預，實驗分組為：對照組(Control)，ALD組(10 μmol·L-1ALD)，CVB-D組(ALD 10 μmol·L-1+1 μmol·L-1 CVB-D)，BAPTA-AM組(0.5 μmol·L-1BAPTA-AM)， ALD+BAP TA-AM給藥組(0.5 μmol·L-1BAPTA-AM+10 μmol·L-1ALD)，ALD+3- BAPTA-AM+CVB-D共給藥組(0.5 μmol·L-1BAPTA-AM +10 μmol·L-1ALD+1 μmol·L-1CVB-D)；② 給予A23187 干預，實驗分組為：對照組(Control)，ALD組(10 μmol·L-1ALD)，CVB-D組(ALD 10 μmol·L-1+1 μmol·L-1CVB-D)，A23187組(1 μmol·L-1A23187)， ALD+A23187共給藥組(1 μmol·L-1A23187+10 μmol·L-1ALD)，ALD+A23187+CVB-D共給藥組(1 μmol·L-1A23187+10 μmol·L-1ALD+1 μmol·L-1CVB-D)；③ 給予KN93 干預，實驗分組為：對照組(Control)，ALD組(10 μmol·L-1ALD)，CVB-D組(ALD 10 μmol·L-1+1 μmol·L-1CVB-D)，KN93組(1 μmol·L-1KN93)， ALD+KN93共給藥組(1 μmol·L-1KN93 + 10 μmol·L-1ALD)，ALD+KN93+CVB-D共給藥組(1 μmol·L-1KN93+10 μmol·L-1ALD+1 μmol·L-1CVB-D)。

2.3 MTT法檢測細胞活力以1×106個·mL-1的心肌細胞接種到96孔板中，培養72 h后，分別給予藥物ALD(0.1、1、10、100 μmol·L-1)作用細胞48 h和共給予CVB-D(0.1、0.5、1和10 μmol·L-1)和Spir.(1 μmol·L-1)作用48 h，每組設6個復孔，實驗重復3次。加入MTT孵育4 h，再加DMSO溶解后，在490 nm波長處測定各孔吸光度，用以下公式計算細胞存活率。

細胞存活率/%=給藥組OD/空白組OD×100%

2.4 Giemsa染色觀察細胞形態將細胞接種于6孔板中，按2.2.2項下實驗分組進行給藥處理后，棄掉培養基，加入PBS清洗后并用4%的多聚甲醛固定30 min，PBS清洗后。每孔中加入500 μL A液，靜置2 min，再往同一孔中加入1 mL的B液，混勻，靜置5 min。PBS洗滌3次后，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.5 Fluo-4AM 熒光探針檢測胞內鈣離子水平將細胞接種于6孔板中，按2.2.2項下實驗分組進行給藥處理后，避光條件下，加入2 μmol·L-1Fluo-4AM 共同孵育30 min 后，用PBS輕洗細胞2次，通過多功能酶標儀中測定熒光值(激發波長：488 nm，發射波長：527 nm)，并在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 Western blot檢測相關蛋白的表達將細胞接種于6孔板中，細胞給藥處理后，用預冷的PBS輕洗，加入含蛋白酶抑制劑PMSF的RIPA裂解液(PMSF ∶RIPA=1 ∶99)裂解細胞提取各組總蛋白，蛋白定量分裝后經SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，采用濕轉法轉膜1.5 h，5%的脫脂奶粉封閉1.5 h，加入相應的一抗Bcl-2(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)、Cleaved caspase-9(1 ∶800)、CaMK Ⅱ(1 ∶1 000)、p-CaMK Ⅱ (1 ∶800)；GAPDH(1 ∶10 000)，4 ℃孵育過夜。次日，1×TBST洗滌后加入二抗(1 ∶10 000)室溫孵育2 h，避光加入ECL化學發光液，采用Bio-Rad蛋白質印跡成像系統采集圖像，ImageLab 4.0軟件分析蛋白條帶灰度值。

3 結果

3.1 ALD誘導PNRCMs損傷和CVB-D保護濃度的確定免疫熒光結果顯示，胞核被DAPI染成藍色，胞質呈綠色條索狀，以細胞純度達90%以上用于后續實驗，見Fig 1A。MTT結果顯示，不同濃度的ALD作用48 h后對細胞活力有一定的損傷作用，呈劑量依賴性，其中10 μmol·L-1的ALD濃度造成25.4%的細胞損傷(P<0.01)。給予不同濃度的CVB-D能夠改善ALD誘導的細胞損傷，呈劑量依賴性，見Fig 1B和C。

Fig 1 Determination of modeling concentration of ALD and protection concentration of A: PNRCMs purity was identified by immunofluorescence(×400); B: The optimal concentration of ALD; C: Protective concentration of CVB-D.##P<0.01 vs Control;*P<0.05,**P<0.01 vs ALD.

Fig 2 Effect of CVB-D on PNRCMs pathological morphology induced by ALD(×200)

3.2 CVB-D對ALD誘導的PNRCMs形態變化的影響Giemsa染色結果顯示，正常Control組的PNRCMs為星形、多角形等不規則形狀，胞核與胞質分界明顯，輪廓清晰。ALD組中細胞數量明顯減少，且細胞不同程度的肥大，胞核皺縮，胞體間隙變大出現空泡化，胞核與胞質分界模糊。給予不同濃度的CVB-D處理后，可改善ALD介導的細胞病理形態變化，見Fig 2。

3.3 CVB-D對凋亡相關蛋白Bcl-2，Bax，Cleaved caspase-9表達的影響Western blot 結果顯示，與Control組比較，ALD組中Bcl-2/Bax的比值顯著下調，Cleaved caspase-9的表達顯著上調(P<0.01)，給予CVB-D低、高劑量可呈劑量依賴性上調Bcl-2/Bax的比值，下調Cleaved caspase-9蛋白的表達(P<0.05，P<0.01)，見Fig 3。

Fig 3 Effect of CVB-D on apoptosis-related protein Bax, Bcl-2,Cleaved caspase-9 expression in PNRCMs induced by ##P<0.01 vs Control;*P<0.05,**P<0.01 vs ALD.

3.4 CVB-D對ALD誘導的胞內Ca2+濃度和CaMK Ⅱ磷酸化的影響胞內鈣離子的累積可促進CaMK Ⅱ 的磷酸化，進而參與心肌細胞凋亡進程。因此，本研究分析CVB-D在ALD條件下對胞內Ca2+濃度和CaMK Ⅱ表達的影響。結果顯示，與Control組比較，ALD組中Ca2+濃度顯著增強(P<0.01)，不同劑量的CVB-D 處理后Ca2+濃度顯著降低(P<0.05)，見Fig 4A。Western blot結果顯示，與Control組比較。ALD組中p-CaMK Ⅱ 的表達顯著增加(P<0.01)，給予CVB-D干預處理后，可抑制p-CaMK Ⅱ的表達(P<0.05)，見Fig 4B。

3.5 CVB-D通過抑制胞內Ca2+超載改善ALD誘導的PNRCMs損傷Western blot結果顯示，與Control 組比較，給予BAPTA-AM 后顯著上調Bcl-2/Bax的比值，下調Cleaved caspase-9的表達(P<0.01) ；在ALD條件下，當單獨給予CVB-D和BAPTA-AM時，能夠顯著的逆轉ALD介導的Bcl-2/Bax 的下調和Cleaved caspase-9的上調，同時給予CVB-D和BAPTA-AM共孵育時，能夠進一步的上調Bcl-2/Bax的比值，下調Cleaved caspase-9 的表達(P<0.05)，見Fig 5A。然而，給予A23187時，可促進ALD介導的Bcl-2/Bax的下調和Cleaved caspase-9的上調，當A23187與CVB-D聯用后，A23187抑制了CVB-D上調Bcl-2/Bax的比值，下調Cleavedcaspase-9的表達(P<0.05)，見Fig 5B。

3.6 CVB-D通過調控CaMK Ⅱ改善ALD誘導的PNRCMs損傷Western blot結果顯示，給予CaMK Ⅱ抑制劑(KN93)后，與正常Control組比較，KN93能夠顯著上調Bcl-2/Bax的比值，下調Cleaved caspase-9的比值(P<0.05)。在ALD條件下，給予CVB-D和KN93均可上調Bcl-2/Bax的比值，下調Cleaved caspase-9的比值，當CVB-D和KN93聯用后進一步增強了兩藥單用的作用效果(P<0.05)，見Fig 6。

Fig 6 Effect of KN93 on expression of apoptosis-related proteins Bcl-2, Bax, Cleaved caspase-9 ##P<0.01 vs Control;*P<0.05,**P<0.01 vs ALD;△P<0.05 vs ALD+CVB-D.

Fig 5 Effects of BAPTA-AM and A23187 on expression of apoptosis-related proteins Bcl-2, Bax,Cleaved caspase-9 in ALD-induced A: Effect of BAPTA-AM on the expression of Bcl-2, Bax, Cleaved caspase-9 protein; B: Effect of A23187 on the expression of Bcl-2, Bax, Cleaved caspase-9 protein.##P<0.01 vs Control;*P<0.05,**P<0.01 vs ALD;△P<0.05,△△P<0.01 vs ALD+CVB-D.

Fig 4 Increase of Ca2+ concentration and CaMKII phosphorylation induced by ALD in PNRCMs inhibited by Intracellular calcium detected by Fluo-4AM; B: CaMKⅡ and p-CaMKⅡ were detected by Western blot.##P<0.01 vs Control;*P<0.05,**P<0.01 vs ALD.

4 討論

心血管系統疾病是危害人類健康的頭號殺手，具有高患病率、高致殘率和高死亡率的特點[11]。心肌細胞為終末分化細胞，不可再生，由于心肌細胞功能的特殊性，保護心肌細胞免受損傷尤為重要。越來越多的研究發現，高濃度的ALD對心臟結構和功能產生不良作用，是引起心臟損傷、重塑和衰竭的重要因子[12]。因此，明確ALD介導心肌細胞損傷的病理新機制，尋找可改善心肌損傷的天然藥物意義重大。

CVB-D是中藥黃楊木的主要藥效成分，是我國自主研發用于治療胸痹心痛的創新藥物，對心血管疾病具有良好的藥理作用。本實驗研究表明，ALD顯著降低了PNRCMs的活力，導致PNRCMs病理形態異常，下調Bcl-2/Bax的比值，上調Cleaved caspase-9蛋白的表達，而CVB-D呈劑量依賴性的逆轉以上現象。表明CVB-D對ALD誘導的PNRCMs損傷具有一定的保護作用。

胞內鈣離子穩態是維持心肌細胞正常功能的關鍵物質。由胞內Ca2+激活的CaMK Ⅱ在心肌肥厚、凋亡和心衰等疾病中發揮著重要的作用[13]。本研究結果顯示，ALD可增加胞內Ca2+累積，促進CaMK Ⅱ磷酸化，給予不同劑量的CVB-D后可改善胞內Ca2+累積，并抑制CaMK Ⅱ的活化。提示ALD介導的心肌細胞損傷與胞內Ca2+超載和CaMK Ⅱ的磷酸化相關。進一步分析表明，BAPTA-AM和KN93促進而A23187減弱CVB-D對ALD介導的PNRCMs損傷的保護作用。以上結果表明，Ca2+累積和CaMK Ⅱ的活化在ALD介導的PNRCMs損傷模型中發揮不利作用。然而，有文獻報道，在鈣液灌注造成的急性鈣超載心肌損傷模型和缺血/再灌注心肌損傷模型中，CaMK Ⅱ可能具有心肌保護作用，這可能與CaMK Ⅱ通過代償性活性改變起到維持Ca2+穩態作用有關[14-15]。因此，關于CaMK Ⅱ在不同心肌損傷模型中的作用有待進一步的探究。

綜上，本實驗研究表明，ALD介導的PNRCMs損傷與胞內Ca2+超載和CaMK Ⅱ的磷酸化相關，CVB-D可通過調控Ca2+/CaMK Ⅱ信號改善ALD介導的PNRCMs損傷，但其在體內的安全性、有效性及具體的調節機制仍需通過整體動物實驗以及離體器官進一步深入研究。