大麥若葉青汁粉總三萜超聲提取工藝研究

陳 瓊，許雪華，蔣變玲

(宿州學院 生物與食品工程學院，宿州 234000)

大麥屬一年生禾本科植物，而大麥若葉是生長到15 ～ 30 cm的大麥嫩葉[1].大麥若葉保健品起源于1960～1970年，一位日本醫學博士(荻原義秀)飲用麥苗汁一定時間后，因汞中毒而嚴重受損的身體恢復了健康，隨后發表相關論文，并促進大麥苗汁保健品的商業化[2].進入21世紀后，伴隨麥綠素系列保健品迅速風靡美國、香港、新加坡等地，而對大麥苗的研究成為新的熱點[2-3].王曉潔等[4]、Panthi Mamata等[5]的研究表明，大麥苗不但具有抗氧化、穩定紅細胞膜、抗疲勞、提高機體免疫力和增強耐力的作用，而且具有顯著的消炎作用.張秋英等[6]通過臨床觀察表明，麥苗粉可改善寢息和記憶、促進傷愈、緩解不適、促進排毒和延緩衰老等功效.王煒等[1]推斷，大麥苗的功效可能與其抗氧化酶類、葉綠素、黃酮類等活性物質有關.此外，大麥苗中的各類豐富的營養素和膳食纖維[1]以及其他功能性成分如多酚[6]、γ-氨基丁酸[7]等受到較多關注，但尚缺乏關于大麥若葉中總三萜的報道.

三萜類化合物還具有抗菌抗炎、抑制腫瘤、調節血糖、防治心血管疾病等諸多功能[8].對于天然物質中活性成分總三萜化合物成分的提取，國內外已有較多的方法，目前常采用以下提取方法：傳統浸提法(包括回流提取法、浸提法和水煮醇沉法)[9]，該方法耗時，有效成分易受破壞，且提取效率有限[10]；超臨界CO2提取[11]，該方法價格昂貴，運行消耗較大，清洗維護困難，生產成本高，難以產業化生產[12]；實際應用中，微波提取法[13]不能用于熱敏感性物質的提取[14]；超聲波提取法[15]可加速有效成分溶出，縮短提取時間并提高提取率，亦免去高溫對提取成分的影響[16].本研究采取超聲助提的方式提取大麥若葉青汁粉中的總三萜，并運用響應面軟件優化大麥若葉青汁粉總三萜提取條件.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大麥若葉青汁粉(隨州市萬松堂康匯有限公司)；香草醛(分析純)(國藥集團化學試劑有限公司)；熊果酸(≥98%)(庫爾化學科技(北京)有限公司).

722N紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)；KQ5200DE超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)；FA-N精密電子天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司)；H1850臺式高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司).

1.2 試驗方法

1.2.1 總三萜含量測定

總三萜含量測定參照劉奇等[17]的研究方法，略有改進.

標準曲線的繪制：配制0.18 mg/mL的熊果酸標準品母液.分別吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL標準品母液于試管中，用沸水浴揮干溶劑后，依次加入0.2 mL香草醛-冰乙酸(5%，現配)及0.8 mL的HClO4，迅速振蕩混勻，70 ℃水浴15 min后冷水浴冷卻至室溫.加入5 mL的冰乙酸搖勻，避光處反應30 min.空白以乙醇代替熊果酸標液，于546 nm處測定吸光度.以吸光度值為Y軸，熊果酸質量為X軸，繪制標準曲線.所得標準曲線為y=8.6889x-0.0046，R2= 0.9913.

大麥若葉青汁粉中總三萜的測定：將單因素試驗的提取液于3 500 r/min下離心15 min，上清液為待測液.吸取0.2 mL待測液，沸水浴揮干溶劑.后續操作如標準曲線的繪制，計算大麥若葉青汁粉中總三萜的得率，公式如下:

式中：X為所得標曲中大麥若葉青汁粉總三萜的質量/mg；V為超聲溶劑體積/mL；M為大麥若葉青汁粉質量/g；n表示稀釋倍數.

1.2.2 單因素試驗

精確稱取1.00 g大麥若葉青汁粉，提取工藝條件見表1，分別考察乙醇濃度、液料比、超聲時間和功率對大麥若葉青汁粉總三萜提取得率的影響.

表1 單因素試驗

1.2.3 響應面法優化試驗設計

因提取功率在80 W后對總三萜提取率的影響不顯著，故不作為響應面法優化的考慮因素.根據單因素實驗結果，確定因素為乙醇濃度、液料比和超聲時間，因素代碼分別為A、B、C，選取相應因素下總三萜提取率較高的3個水平(-1、0、1，分別代表最大值左側值、最大值、最大值右側值).運用Design-Expert 8.06軟件，選取Box-Benhnken中心組合實驗設計原理，以總三萜提取率為響應值，對提取條件進行優化，響應面法優化試驗設計見表2.

表2 響應面分析因素和水平

1.2.4 數據分析

所有測定均進行3次平行試驗，結果表示為平均值±標準差，采用SPSS 20.0進行Duncan’s差異性分析(P<0.05)和單樣本t檢驗，運用軟件Design-Expert 8.06進行響應面分析.

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇對大麥若葉青汁粉總三萜提取得率的影響

運用SPSS軟件統計分析的結果如圖1，圖中5個點是5組數據的平均值. 運用SPSS對這5組數據進行兩兩比較以分析數據之間有沒有統計學上的差異，用字母a～d表示總三萜得率從高到低，同一字母表示組之間無顯著差異，不同字母代表差異顯著(P<0.05)(以下所有圖同).

圖1 乙醇體積分數對總三萜得率的影響

由圖1可知，當濃度在50%～60%時，總三萜得率驟增；而在60%～80%時，總三萜得率平穩遞增.當濃度在80%～90%區間時，總三萜得率隨乙醇濃度的增加反而降低.推測其原因可能是：當乙醇體積分數大于80%時，蛋白凝固產生傳質阻力，阻礙青汁粉中三萜的提取[18]；或者大麥若葉中三萜為弱極性物質，與80%乙醇極性相似，隨乙醇濃度增加，溶劑極性改變而溶解度降低[19]；抑或乙醇濃度過大導致多糖、蛋白質等大分子物質產生凝聚和阻滯，堵塞組織微孔，致使三萜擴散阻力增加[20].而且乙醇濃度過高會造成成本不必要的消耗，所以，最佳乙醇濃度是80%.

2.1.2 液料比對大麥若葉青汁粉總三萜提取得率的影響

液料比對大麥若葉青汁粉總三萜提取得率的影響如圖2，圖中不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05).

圖2 液料比對總三萜得率的影響

由圖2可得，在液料比10∶1 ～ 20∶1之間，提取率隨液料比增加而增加，原因為液料比增加，三萜酸類在物料和溶劑之前濃度差增加，有利于傳質作用[21]，且不利于超聲空化作用[17].在液料比為20∶1時三萜提取率達到峰值，隨后料液比增加，提取率下降.推測物料中的三萜含量有限，隨液料比增加，在相同時間內體系升溫較慢，從而影響提取[22].因此，最佳液料比為20∶1.

2.1.3 超聲時間對大麥若葉青汁粉總三萜提取得率的影響

超聲時間對大麥若葉青汁粉總三萜提取得率的影響如圖3.由圖3可知，在超聲20 min時，大麥若葉青汁粉總三萜得率達到峰值.推測超聲時間過短，大麥若葉青汁粉中的三萜物質還沒有完全從物料中溶解擴散到溶劑中；而在超聲時間超過20 min后三萜得率顯著下降，推測物料在持續超聲作用下，機械剪切力會破壞溶出的三萜類物質，使得三萜得率下降，并且會引起其他醇溶性物質的析出，與三萜競爭溶劑，從而使總三萜的提取率下降[22].所以20 min為最佳超聲提取時間.

圖3 超聲時間對總三萜得率的影響

2.1.4 超聲功率對大麥若葉青汁粉總三萜提取得率的影響

超聲功率對大麥若葉青汁粉總三萜提取得率的影響如圖4.

圖4 超聲功率對總三萜得率的影響

由圖4可見，總三萜得率在功率60～80 W之間時隨功率增加呈折線式上升.推測增強的超聲功率使大麥若葉細胞壁破碎增加，致使三萜提取率增加.當超聲功率為80 W時，得率最大，而后變化不顯著.因此最佳超聲功率為80 W.超聲功率過大，加快的溶液分子運動可能破壞三萜結構[17].

2.2 響應面法優化提取工藝

2.2.1 Box-Behnken試驗設計及結果

根據單因素試驗結果，設定因素代碼A、B、C以及選取3個水平(-1、0、1)，通過Box-Benhnken中心組合實驗設計，得到17組試驗方案，并據此進行提取分析，相關數據如表3.

2.2.2 模型的建立以及方差分析

根據試驗數據建立大麥若葉青汁粉總三萜提取得率與3個因素間的反應關系，用R表示青汁粉總三萜的提取得率所得方程式為：

R= 21.92-0.18A+3.31B+0.68C+1.08AB-1.15AC+4.09BC-2.08A2-5.16B2-4.81C2.回歸系數方差分析見表4.

由方差分析看出，A2對三萜得率影響顯著(P<0.05)，B、BC、B2、C2對總三萜得率影響為極顯著(P<0.01).由F檢驗得，各因素影響大小順序為：液料比> 超聲時間>乙醇體積分數%.模型的F值為28.29且P=0.0001(<0.01)，相關系數R2=0.9732，說明該模型擬合效果極顯著，該模型有效，模型預測值和三萜提取率試驗值具有良好的一致性.失擬項P值為0.0910(>0.05)，失擬不顯著，說明實際值和模型預測值不擬合的概率較小.而信噪比為16.967，遠大于4，說明該模型適合指導工藝優化.綜上，該方程的擬合度很好，可以用于優化和預測大麥若葉青汁粉總三萜提取最佳工藝.

2.2.3 響應曲面分析

通過Box-Behnken試驗得到的二次回歸模型所作的響應面圖及等高線如圖5-圖7，可用于評價各因素間交互作用對大麥若葉青汁粉總三萜提取得率的影響，并且確定各因素的最佳水平范圍.響應曲面坡度平緩，等高線呈圓形，則說明二者的相互作用弱，反之則強[22].由表3可見，液料比和超聲時間之間交互作用顯著，可由圖7直觀反映出.

表3 試驗設計與結果

表4 回歸方程系數方差分析表

圖5 乙醇體積分數和液料比交互作用的響應曲面圖和等高線圖

圖6 超聲時間和乙醇體積分數交互作用的響應曲面圖和等高線圖

圖7 超聲時間和液料比交互作用的響應曲面圖和等高線圖

2.3 最佳提取工藝的驗證

根據模型分析可知，大麥若葉青汁粉總三萜提取的最佳條件是：乙醇79.97 %，超聲22.50 min，液料比為24.20∶1，大麥若葉青汁粉總三萜預測值為22.70 mg/g.考慮到現實操作的限制，將乙醇體積分數修正為80%，液料比為24∶1，超聲時間選擇22 min，超聲功率定為80 W.按照修整后條件進行提取，總三萜得率為21.69 mg/g，將實測值與理論預測值進行單樣本t檢驗，結果見表4.

系統計算分析得出t為-1.572，雙側Sig.值0.257>0.05，實測值和理論值之間不存在顯著差異，說明響應面可以很好地預測大麥若葉青汁粉中總三萜得率.

表5 三萜得率與預測值的單樣本t檢驗

3 結論

以大麥若葉青汁粉為試驗原料，用超聲波輔助提取大麥若葉青汁粉中的總三萜，考慮多個因素對大麥若葉青汁粉總三萜含量的影響，再以此為數據基礎，用響應面軟件進行優化，預測最優提取工藝，最終獲得的提取條件為：液料比為24∶1 (mL/g)，超聲22 min，乙醇80%，實測總三萜得率為21.69 mg/g.同時，超聲提取相比傳統提取方法在成本消耗、環境污染、提取時間、設備維護、有效成分的含量等上面均有著較多優勢.超聲助提與響應面法的結合，很大程度上促進了大麥若葉青汁粉總三萜的浸出率，為其開發利用提供依據和基礎.