具核梭桿菌致病性及防治＊

胡婷婷,傅思武,金 悅，張 祎，馬桂燕

（西北民族大學醫學院，甘肅 蘭州 730030）

隨著人們對微生物群落在人類疾病中的認識不斷加深，對F.nucleatum 的研究已有一個世紀之久，從先后毒力因子的研究，FusoPortal（http://fusoportal.org）梭桿菌屬基因組、蛋白質分析儲存庫的逐漸建立[1]，人們對這類梭桿菌的研究正在形成一套系統的模式。F.nucleatum 作為腸道菌群，其致病性尤其在CRC 致癌方面發揮著越來越重要的作用，同時消化系統疾病仍然是未來鉆研的方向。鑒于其具體的致病及相關化療耐藥機制還在研究中，同時缺乏對其明確的防治手段，本文就最近主要在其致癌方面研究作一介紹，為后續工作提供參考。

1 F.nucleatum 與消化系統疾病

1.1 口腔

F.nucleatum 是口腔生物膜重要組成部分，借助其自身表面不同黏附素以及特殊的生物學形態，可以與多種口腔代表菌共聚合，以及與多種口腔宿主細胞發生作用，在口腔中常導致早期炎癥的發生。口腔鱗狀細胞癌（OSCC）可以出現在口腔任何部位，其發病率以及致死率居各類口腔癌首位，Al-hebshi等[2]通過檢測OSCC 組織切片和口腔上皮組織中各細菌基因富集程度，發現各細菌之間在種、屬上均具有顯著差異，其中F.nucleatum 多形亞種、銅綠假單胞菌和彎曲桿菌相關性最強，在對照組中發現，ATP 結合蛋白、8-oxoG 三磷酸酶等在基因代謝途徑中過表達。F.nucleatum 感染OSCC 細胞Tca8113 引起DNA 雙鏈斷裂損傷（DSB），當細胞修復不足時，則通過激活Ku70/p53 通路致舌鱗癌細胞增殖，促使OSCC 發生[3]。人牙齦成纖維細胞(HGFs)是牙齦結締組織中最豐富的固有細胞，研究[4]發現，F.nucleatum通過刺激一種AKT/MAPK 和NF-κB 信號通路，致HGFs 細胞凋亡、細胞內活性氧（ROS）和促炎細胞因子顯著增加，并提出了其初步致病機制。F.nucleatum能夠通過調控MIR4435-2HG/miR-296-5p/Akt2/SNAI1 信號通路，在正常和癌變的口腔上皮細胞中觸發上皮間質轉化（EMT），可能推動了OSCC 進展[5]。

血管反應是牙周疾病重要免疫過程，F.nucleatum 直接作用于血管內皮細胞，會刺激CD31、血管內皮生長因子等的改變，從而抑制了內皮細胞的增殖 和 成 管 能 力[6]。El-Awady 等[7]使 用SEM 評 估 了F.nucleatum、格氏鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌體外成膜能力，三者之間協同作用促進了對人單核細胞來源的樹突狀細胞（MoDCs）的侵襲性，破壞DC 成熟，在牙周炎患者血液中約99%的F.nucleatum 是由PanDCs 攜帶，其對DC 參與牙髓根尖周疾病等的免疫應答可能產生影響。最近提出了梭菌CEACAM 結合蛋白(CbpF)的概念，其具體功能還未得到定義，但鑒定了F.nucleatum 能借助黏附素TAA 靶向人類CEACAM1，參與對牙齦組織的定植和侵襲，其中以具核和文森氏亞型表現突出[8]。

1.2 食管

食管中的正常菌群以鏈球菌屬為主，質子泵抑制劑(PPI)、膳食營養、胃內容物環境等因素可能會使食管微生物結構改變。其中食管癌（esophagus cancer，EC）是最為常見的惡性腫瘤之一，我國90%的食管癌為鱗狀細胞癌（ESCC）。Yamamura等[9]用qPCR 法對325 例EC 組織中F.nucleatum定量檢測，有74 例組織F.nucleatumDNA 檢測陽性，其與腫瘤分期顯著相關，而與年齡、性別、腫瘤位置等不相關，尤其在晚期ESCC 中F.nucleatum 感染更顯著[31]，在進一步分析中CCL20 是上調最多的炎癥趨化因子，該因子由F.nucleatum 激活產生并增加了腫瘤侵襲力。Liu 等[10]在284 份EC 組織中發現，F.nucleatum 感染陽性組比陰性對照組含有較高水平的ULK1 和ATG7 表達，兩者都參與細胞自噬調節。

1.3 化膿性肝膿腫

F.nucleatum 引起的肝膿腫較為少見，但這種感染是潛在的，并可迅速進展。口腔衛生狀況可能是其感染的主要原因，而與免疫力、年齡等因素相關性較小[11]。Hooshmand[12]等研究表明，F.nucleatum 慢性炎癥過程中，會導致亞急性感染患者出現類似放線菌樣病變，表現為肝組織廣泛壞死和纖維化，外科膿腫引流和抗生素治療是其主要治療方法。

1.4 IBD

IBD 主要包括克羅恩病(Crohn's disease，CD)和潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)，有關F.nucleatum 誘導IBD 發生的機制還不清楚。有研究[13-15]證實，F.nucleatum 同樣在CD 和UC 中富集，通過靶向CARD3 分子的上調，介導內質網ERS 通路激活，促進腸黏膜屏障的破壞導致CD 發生[13]。CARD3 作為重要節點，其通過NOD2 激活體內外IL-17F/NFκB 途徑，促進IL-1β、IL-6、IL-17F 和TNF-α 等炎性細胞因子表達，促使UC 發展[14]。另有研究[15]發現F.nucleatum 誘導M1 巨噬細胞極化，通過AKT2途徑分泌大量炎性因子TNF-α、IFN-γ 等，損害腸道粘膜上皮屏障，增加腸道滲透性和細菌易位，導致炎癥增加和疾病的進展。

1.5 CRC

CRC 是第三大最常見的癌癥，在CRC 患者唾液、結直腸組織和糞便中F.nucleatum 均有較高水平表達，CRC 檢出率在10%～90%之間[21]。CRC 與F.nucleatum 的關系是近年來討論的焦點，流行病學調查中，不同國家和地區之間的研究多數是CRC 與正常大腸組織中F.nucleatum 豐度的比較，其關聯性研究的檢測方法和結果存在差異，同時也提出了是否與種族、抗生素的使用等有關[16]。而直至目前，其參與CRC 癌變的機制仍未完全闡明。基于Gholizadeh等[17]與Goradel 等人[18]提出的F.nucleatum 毒力因子(Fap2、FadA、LPS)、免疫調節因素、miRNAs 和細菌代謝四種機制，在此做一概括和擴展。F.nucleatum 自轉運蛋白Fap2 結合存在于NK 細胞和T 細胞上的抑制性受體TIGIT，進而抑制NK 細胞和T 細胞活性，腫瘤借此發生免疫逃逸現象[19]，對此，提出該觀點的Gur C 在其另一項研究中表明，可以考慮用CEACAM1 和TIGIT 抑制劑，特異性靶向治療由F.nucleatum 定植的腫瘤[20]。Fap2 的另一個受體是位于結腸細胞表面的Gal-GalNAc，它是F.nucleatum 富集、CRC 定位的標志物，其有望成為新的治療靶點[17]。

黏附素FadA 參與E-cadherin/β-catenin 途徑，一方面激活IL-6/8/18 等促炎因子，另一方面刺激癌基因如Myc 等表達。Rubinstein 等[21]提出FadA 可通過E-cadherin 誘導Wnt/β-catenin 通路繼而上調Annexin A1 的表達，Annexin A1 在CRC 細 胞中特異存在，是預后不良的預測因子，Annexin A1 表達上調的患者預后更差，該模型通過驅動體細胞基因突變和F.nucleatum 感染的“雙hit”擴展了其致癌模型。miRNAs 能參與腫瘤細胞遷移、增殖、侵襲和分化，F.nucleatum 參與miRNAs 調控時，在CRC 組織中，與癌癥信號相關的基因TP53、JUN、PRKACB等表達失調，而miR-4474/4717 通過CREBBP 靶基因轉錄后，可調控CRC 的進展，該分析表明，CREBBP 是F.nucleatum 誘導CRC 異常表達的主要基因[22]。F.nucleatum 感染腸黏膜產生ROS 等炎癥因子，致使CpG 島的高甲基化（CIMP）、腫瘤高度微衛星不穩定性（MSI-H）和hMLH1 甲基化等CRC 的遺傳和表觀遺傳異常[23-25]，在MSI-H 的CRC 中富含CD4+/CD8+T 細胞、NK 細胞等具有抗腫瘤的淋巴細胞，即MSI-H 的患者預后免疫評分也越高；而另一方面，F.nucleatum 入侵CRC 致DNA 損傷（如8-oxoG），或產生的IL-6、PGE2 可能誘導了MSH3 從CRC 細胞核向細胞質轉移，導致MSI-L、EMAST，與非MSI-H 和非MSI-L、EMAST 的CRC 相比，MSIL、EMAST 的無復發生存率（recurrence-free survival，RFS）更短[23]。

CRC 轉移是大多數患者死亡的主要原因，研究[26]發現，F.nucleatum 通過上調CARD3 和激活自噬途徑，刺激CRC 細胞中自噬小體形成、自噬相關蛋白表達等促進了CRC 轉移，F.nucleatum 豐度與CARD3 表達呈正相關。CARD3 在F.nucleatum 誘導的IBD 炎癥發生、CRC 自噬調節中存在關聯，但具體機制還不明確。

2 其他相關疾病

目前主要與消化系統疾病發生發展的研究明顯日趨增加逐漸深入，其中又以對CRC 的致癌性為焦點。既往與F.nucleatum 相關的其他系統疾病研究相對較少，但仍然存在潛在感染致病風險。在8.8%的胰腺癌組織中存在F.nucleatum，與胃癌也有一定關聯[17]。在以后研究中，F.nucleatum 成為全身致病的共同因素會達成共識，尤以其致癌性應深入探究。

3 防治措施

3.1 免疫治療

從口腔到胃腸道，大多數口腔微生物由口腔沿消化道異位定植是頻繁連續的過程，腸道微生物組的組成可顯著影響免疫治療和化療的反應。針對F.nucleatum 引起的各類感染性疾病，應更多靶向其毒力因子或致病信號通路節點研發藥物。F.nucleatum代謝產生的H2S 不僅帶來口腔異味，還會增強細胞的抗氧化能力，降低機體對抗生素的敏感性，Wang等人[27]從雞蛋黃中提取出lgY 針對口腔異味進行了療效評估，選擇適宜濃度的lgY 對F.nucleatum 引起的口臭和牙周炎有治療作用。烷基過氧化氫還原酶亞單位C（AhpC）可保護專性厭氧菌免受過氧化氫類物質的侵害，Guo 等人[32]發現F.nucleatum 感染陽性CRC 患者血清中的抗體能特異性識別重組蛋白Fn-AhpC，通過預防性免疫小鼠，77.3%的小鼠IgG水平升高；且AhpC 比F.nucleatum 的外膜孔道FomA 蛋白具有更強免疫反應，AhpC 序列與宿主和共生菌的同源性也較低或適中，如此或將AhpC 作為對抗腸道內F.nucleatum 感染提供了一種具有可行性的備選疫苗。Liu[33]等報道了以自轉運蛋白為主的F.nucleatum 的外膜囊泡（OMV）蛋白質組學特征，利用OMVs 暴露的抗原表位對F.nucleatum 的疫苗設計生產和有效預防CRC 帶來巨大潛力。

3.2 化療

目前CRC 的治療包括手術、化療和放療。化療耐藥是腫瘤頑固性復發的原因之一。F.nucleatum 通過TLR4/MyD88 依賴機制，調控miR-18a×/4802 在F.nucleatum 培養的細胞中選擇性缺失，分別誘導自噬原件ULK1、ATG7 激活，導致CRC 細胞自噬，促使CRC 細胞對奧沙利鉑、5-氟尿嘧啶(5-FU) 的耐藥，增加了CRC 患者的耐藥性[28]，此外，這一機制還通過調節NF-κB、P65 等因子，顯著上調CRC 細胞HCT116 和HT29 中凋亡抑制蛋白BIRC3 的表達，BIRC3 抑制了caspase-3 對CRC 的凋亡作用，促進晚期CRC 對5-FU 的耐藥，同時也檢測到低水平的RFS 與F.nucleatum 和BIRC3 的 高 表 達 有 關[29]。Anoctamin-1(ANO1)為一種氯離子通道蛋白，在多種腫瘤中表達上調，F.nucleatum 通過與F.nucleatum共培養的HCT116 和HT29 促進了CRC 細胞中ANO1 的表達，而ANO1 的過表達阻止了奧沙利鉑、5-FU 誘導的凋亡效應[30]。局部晚期的ESCC 宜先適用新輔助化放化療（NAC），其次手術治療，F.nucleatum 的高表達與ESCC 的RFS 相關，影響到NAC 療效時，抗生素早期干預有助于改善治療[31]。

3.3 噬菌體

在如今多耐藥菌增加的情況下，噬菌體抗菌療法已正在成為一種具有前途的治療手段。之前報道過噬菌體FnpΦ2 的分離鑒定，以及F.nucleatum 亞型中的溫和性噬菌體ΦFunu1 和ΦFunu2 的基因組特征的研究，最近從F.nucleatum 中分離出一種新型噬菌體FNU1，通過對其形態學、基因組學、功能特征研究發現對F.nucleatum 生物膜有裂解破壞作用[34]，這些噬菌體有望成為探究CRC 以及牙周炎等致病線索以及未來的補充代替治療。此外，已有相關研究[35]機構利用合成生物學技術，對已識別的噬菌體進行優化并最終達到根除CRC 中F.nucleatum 的目的。

3.4 其他

脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylases，PHDs)抑制劑——二甲基乙二酰基甘氨酸（DMOG）可降低多種炎癥性疾病死亡率，研究[36]發現，DMOG 可抑制由F.nucleatum 誘導HGFs 產生的炎癥因子的表達，可能為控制牙周病的發生和發展提供新的治療策略。

4 小結

綜上所述，現階段對F.nucleatum 的研究主要集中在以口腔疾病和CRC 為中心的消化系統疾病，在此探討了分子機制方面的致病效應，后續還需投入更多對其他相關疾病機制的深究，尤其是對CRC 的致癌模型仍待進一步修正完善，對F.nucleatum 各亞型致病力還需鑒別。結合目前看，防治手段還沒有成熟，針對腫瘤患者逐年攀升、化療耐藥等因素，都警醒人們新藥研發迫在眉睫。未來在加快其機制研究的同時還需積極探索診斷、防治、預后等措施。