茯苓提取物以miR-649/Akt1通路調控AngⅡ誘導血管平滑肌細胞的增殖、遷移和侵襲機制

姚衛 黃偉 張斌

心血管疾病是一種嚴重威脅人類尤其是中老年人群健康的常見疾病。動脈粥樣硬化是一個慢性炎癥過程，也是心血管疾病致死的主要原因之一，其中血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的增殖、遷移等是動脈粥樣硬化的關鍵環節[1,2]。血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ，AngⅡ)可介導VSMCs細胞的活化、增殖、遷移等，抑制AngⅡ誘導的VSMCs細胞增殖和遷移對防治心血管疾病具有重要意義[3]。茯苓是中國的一種傳統中藥材，多用于風濕性關節炎、皮膚病等疾病的治療。楊鵬飛[4]研究顯示，桂枝茯苓膠囊可抑制血清誘導的血管平滑肌細胞增殖。目前，茯苓提取物對AngⅡ誘導的VSMCs細胞生物學行為的影響還未知。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類小分子非編碼單鏈RNA，參與調控細胞的增殖、遷移、凋亡等生物學行為，與疾病的發生發展密切相關[5]。研究顯示，miR-649在去血清處理的血管平滑肌細胞中表達增加[6]，提示miR-649可能參與調控VSMCs細胞的生物學行為。本研究通過AngⅡ誘導的VSMCs細胞，探討茯苓提取物對VSMCs細胞增殖、遷移和侵襲的影響及作用機制，以期為動脈粥樣硬化治療藥物的研發提供一定的新方向。

1 材料與方法

1.1 細胞與實驗試劑 人主動脈血管平滑肌細胞(HA-VSMCs)購自美國ScienCell公司；胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)、DMEM高糖培養基和BCA蛋白測定試劑盒購自北京索萊寶公司；胰蛋白酶和四甲基噻唑藍(methylthiazoletrazolium，MTT)購自美國Sigma公司；逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒購自美國Fermentas公司；LipofectamineTM 2000試劑盒和Trizol試劑，美國Invitrogen公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司設計并合成；miR-649模擬物(mimics)及模擬陰性對照物、抑制劑及陰性對照序列、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(serine/threonine protein kinase 1，Aktl)野生型質粒(WT-Aktl)和突變型質粒(MUT-Aktl)，由上海吉凱基因公司合成；兔抗人細胞周期蛋白D1(CyclinD1)、p21多克隆抗體購自多Anbo生物科技有限公司；上皮性鈣粘附蛋白(Epithelial cadherin，E-cadherin)抗體購自武漢維克賽思科技有限公司；基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)、Akt1和磷酸化的Akt1(phosphorylated Aktl，p-Akt1)抗體購自美國Santa Cruz公司；雙熒光素酶活性檢測試劑盒，美國Promega公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備茯苓提取物:參照文獻[7]方法制備茯苓提取物。首先將茯苓中藥飲片粉碎，過200目篩。準確稱取5.0 g樣品，加入200 ml蒸餾水，回流提取1 h。回流結束后，4℃、10 000 r/min離心10 min。取上清液，80℃旋轉蒸發至25 ml左右。然后真空冷凍干燥處理，-20℃保存備用。實驗前，用超純水配置為含生藥量1.0 g/L的溶液，4℃儲存備用。

1.2.2 VSMCs細胞培養:VSMCs細胞用含10 % FBS的DMEM高糖培養基于37℃、5% CO2、97%濕度的培養箱中培養。依據細胞生長狀況，每2～3天更換1次新鮮的培養基。細胞融合至80%～90%時，0.25%胰蛋白酶消化，進行傳代培養。

1.2.3 VSMCs細胞分組處理:VSMCs細胞分組，AngⅡ組：10-7mol/L[8]的AngⅡ作用VSMCs不同時間(24、48和72 h)；AngⅡ+茯苓提取物組：10-7mol/L的AngⅡ與不同濃度的茯苓提取物共同作用VSMCs不同時間；對照組：培養基培養相同時間。miR-649組：轉染miR-649模擬物；miR-NC組：轉染模擬陰性對照物；anti-miR-649組：轉染miR-649抑制劑；anti-miR-NC組：轉染抑制劑陰性對照。具體轉染操作參照LipofectamineTM2000試劑盒操作說明。AngⅡ+miR-649組：10-7mol/L的AngⅡ作用于轉染miR-649 mimics的VSMCs細胞；AngⅡ+miR-NC：10-7mol/L的AngⅡ作用于轉染模擬陰性對照物的VSMCs細胞。AngⅡ+茯苓提取物20 mg/ml+anti-miR-649組：10-7mol/L的AngⅡ與20 mg/ml的茯苓提取物共同作用轉染miR-649抑制劑的VSMCs細胞；AngⅡ+茯苓提取物20 mg/ml+anti-miR-NC組：10-7mol/L的AngⅡ與20 mg/ml的茯苓提取物共同作用轉染抑制劑陰性對照序列的VSMCs細胞。

1.2.4 MTT檢測細胞增殖活性:VSMCs細胞或轉染后的6組VSMCs細胞，以2.5×104個/ml的濃度接種于96孔板中，每孔200 μl。細胞貼壁后，按照上述分組處理。細胞培養結束后，每孔加入20 μl的MTT溶液(5 g/L)，繼續孵育4 h。然后吸棄培養基，加入150 μl 二甲基亞砜，振蕩混合均勻，酶標儀490 nm處測定吸光度值(A)。

1.2.5 Transwell檢測細胞的遷移和侵襲能力:VSMCs細胞或轉染后的6組VSMCs細胞，用不含FBS的DMEM培養基調整濃度為5×104個/ml。細胞遷移實驗：取100 μl細胞懸液加入Transwell上室。下室加入500 μl含FBS的DMEM培養基。培養6 h后，吸棄上室培養基，加入含10-7mol/L的AngⅡ和(或)20 mg/ml茯苓提取物共同作用48 h后。培養結束后，4%多聚甲醛固定30 min，自然晾干后，0.4%結晶紫染色15 min。然后使用倒置顯微鏡觀察，隨機選取5個視野，計數。細胞侵襲實驗：取100 μl細胞懸液加入至鋪有Matrigel基質膠的Transwell上室，剩余操作與細胞遷移實驗相同。

1.2.6 實時熒光定量PCR檢測miR-649表達:Trizol試劑提取細胞中總RNA，并逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，行PCR擴增。PCR擴增條件：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個循環。引物序列：miR-649上游5’-TTTGGGCTACCATGTTCGG-3’；下游5’-CCGAACATGGTAGCCCAAA-3’；U6上游5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；下游5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。以U6為內參，2-ΔΔCt法計算miR-649的相對表達水平。

1.2.7 Western Blot法檢測蛋白表達:加入RIPA蛋白裂解液提取細胞中總蛋白，BCA試劑盒對蛋白進行定量。取適量蛋白，100℃煮沸5 min變性后，以每孔30 μg 蛋白進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，濕轉至硝酸纖維素膜。然后將硝酸纖維素膜置于5 %脫脂牛奶中封閉，時間為2 h。加入一抗，4℃孵育過夜。加入辣根過氧化酶標記的二抗，37℃孵育1 h。加入ELC顯影液，避光顯影，凝膠成像系統曝光拍照。以GAPDH為內參，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因實驗:構建Aktl野生型質粒(WT-Aktl)和突變型質粒(MUT-Aktl)。VSMCs細胞以5×104個/ml的濃度接種于96孔板中，每孔2 ml。代細胞融合至60 %時，分別將WT-Aktl、MUT-Aktl與miR-649 mimic、模擬陰性對照物共轉染至VSMCs細胞。轉染48 h后，收集細胞。參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒操作說明，檢測熒光素酶活性，結果以熒光蟲活性/海腎熒光強度比值表示6組的熒光素酶活性。

2 結果

2.1 茯苓提取物對AngⅡ作用的VSMCs細胞增殖、遷移、侵襲的影響 與對照組比較，AngⅡ組VSMCs細胞培養24、48、72 h后的活性、Cyclin D1蛋白表達水平升高(P<0.05)，P21蛋白表達水平降低(P<0.05)。與AngⅡ組比較，AngⅡ+茯苓提取物(10、20、50 mg/ml)組VSMCs細胞培養24、48、72 h后的活性、Cyclin D1蛋白表達水平降低(P<0.05)，P21蛋白表達水平升高(P<0.05)，且AngⅡ+茯苓提取物20 mg/ml組細胞培養48 h的活性約為AngⅡ組的50%，因此后續實驗選擇20 mg/ml的茯苓提取物作用細胞48 h進行后續實驗。與對照組比較，AngⅡ組VSMCs細胞培養48 h后遷移和侵襲數量、MMP-2蛋白表達水平升高(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達水平降低(P<0.05)。與AngⅡ組比較，AngⅡ+茯苓提取物20 mg/ml組VSMCs細胞培養48 h后遷移和侵襲數量、MMP-2蛋白表達水平降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達水平升高(P<0.05)。見圖1，表1、2。

圖1 茯苓提取物對AngⅡ作用的VSMCs細胞增殖、遷移、侵襲的影響；A 茯苓提取物對AngⅡ作用的VSMCs細胞遷移、侵襲的影響;B 茯苓提取物對AngⅡ作用的VSMCs細胞增殖蛋白表達的影響;C 茯苓提取物對AngⅡ作用的VSMCs細胞遷移、侵襲蛋白表達的影響

表1 茯苓提取物對AngⅡ作用的VSMCs細胞增殖的影響

表2 茯苓提取物對AngⅡ作用的VSMCs細胞遷移、侵襲的影響

2.2 茯苓提取物對AngⅡ作用的VSMCs細胞中miR-649、p-Akt1表達的影響 與對照組比較，AngⅡ組VSMCs細胞培養48 h后miR-649表達水平降低(P<0.05)，Akt1和p-Akt1蛋白表達水平升高(P<0.05)。與AngⅡ組比較，AngⅡ+茯苓提取物20 mg/ml組VSMCs細胞培養48 h后miR-649表達水平升高(P<0.05)，Akt1和p-Akt1蛋白表達水平降低(P<0.05)。見圖2，表3。

表3 茯苓提取物對AngⅡ作用的VSMCs細胞中miR-649、p-Akt1表達的影響

圖2 茯苓提取物對AngⅡ作用的VSMCs細胞Akt1、p-Akt1蛋白表達的影響

2.3 過表達miR-649對AngⅡ作用的VSMCs細胞增殖、遷移和侵襲的影響 AngⅡ+miR-649組miR-649水平高于AngⅡ+miR-NC組，表明miR-649 mimics轉染成功。與AngⅡ+miR-NC組比較，AngⅡ+miR-649組VSMCs細胞培養24、48、72 h后的活性、遷移和侵襲數量、Cyclin D1和MMP-2蛋白表達水平降低(P<0.05)，P21和E-cadherin蛋白表達水平升高(P<0.05)。見圖3，表4、5。

圖3 過表達miR-649對AngⅡ作用的VSMCs細胞增殖、遷移、侵襲蛋白表達的影響

表4 過表達miR-649對AngⅡ作用的VSMCs細胞增殖的影響

表5 過表達miR-649對AngⅡ作用的VSMCs細胞遷移、侵襲的影響

2.4 miR-649靶向調控Akt1表達 生物信息學軟件顯示，Akt1的3’UTR含有與miR-649互補的核苷酸序列。雙熒光素酶活性檢測結果顯示，與miR-NC組比較，miR-649組轉染WT-Akt1的熒光素酶活性降低(P<0.05)，而轉染MUT-Akt1的熒光素酶活性物顯著變化(P>0.05)，說明miR-649可Akt1的3’UTR靶向結合。Western Blot檢測結果顯示，miR-649組Akt1蛋白水平低于miR-NC組(P<0.05)，anti-miR-649組Akt1蛋白水平高于anti-miR-NC組(P<0.05)。見圖4，表6、7。

圖4 miR-649靶向調控Akt1表達；A Akt1的3’UTR含有miR-649的互補序列；B miR-649調控Akt1的表達

表6 雙熒光素酶報告實驗

2.5 抑制miR-649表達能逆轉茯苓提取物對AngⅡ作用的VSMCs細胞增殖、遷移、侵襲的作用 與AngⅡ+茯苓提取物20 mg/ml+anti-miR-NC組比較，AngⅡ+茯苓提取物20 mg/ml+anti-miR-649組VSMCs細胞培養24、48和72 h后的活性、遷移和侵襲數量、Cyclin D1、MMP-2、Akt1和p-Akt1蛋白表達水平升高(P<0.05)，miR-649、P21和E-cadherin蛋白表達水平降低(P<0.05)。見圖5，表8、9。

表7 miR-649調控Akt1的表達

圖5 抑制miR-649表達能逆轉茯苓提取物對AngⅡ作用的VSMCs細胞增殖、遷移、侵襲蛋白表達的影響

表8 抑制miR-649表達能逆轉茯苓提取物對AngⅡ作用的VSMCs細胞增殖的影響

表9 抑制miR-649表達能逆轉茯苓提取物對AngⅡ作用的VSMCs細胞增殖、遷移、侵襲的影響

3 討論

研究顯示，VSMCs細胞的異常增殖、遷移可促進血管動脈粥樣硬化的形成，抑制VSMCs細胞的異常增殖及遷移可有效延緩血管動脈粥樣硬化的發展進程[9]。AngⅡ是一種血管活性物質，可促進VSMCs細胞增殖和遷移。本研究結果顯示，AngⅡ作用VSMCs細胞后，VSMCs細胞增殖、遷移和侵襲能力增加，與增殖、遷移和侵襲相關的蛋白Cyclin D1和MMP-2表達升高，P21和E-cadherin蛋白表達降低，與相關報道結果[10]一致。作為傳統的中藥材，茯苓味甘、淡、性平，具有較高的藥用價值。研究顯示，茯苓提取物可通過激活線粒體介導的caspase途徑抑制非小細胞肺癌A549細胞的增殖[11]，誘導人白血病U937細胞凋亡[12]。本研究結果顯示，茯苓提取物可抑制AngⅡ誘導的VSMCs細胞增殖、遷移和侵襲及Cyclin D1和MMP-2蛋白表達，促進P21和E-cadherin蛋白表達，提示茯苓提取物是潛在的治療血管動脈粥樣硬化的藥物。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類小分子單鏈非編碼RNA，長度為18～25個核苷酸，廣泛存在于真核生物中。研究顯示，miRNA參與VSMCs細胞的生物學特性，在心血管疾病中發揮重要作用。萬正英等[13]研究顯示，miR-425可通過調控 PTEN/PI3K/AKT 信號通路抑制AngⅡ誘導的人主動脈VSMCs細胞增殖和遷移，可作為血管重構的潛在診療靶點。Guo等[14]研究顯示，miR-145可通過靶向負調控CD40表達抑制VSMCs細胞增殖。miR-649是近年來新發現的一種miRNA。目前，miR-649對VSMCs細胞增殖、遷移和影響還未知。本研究結果顯示，AngⅡ作用VSMCs細胞后，細胞中miR-649表達水平降低，提示miR-649參與血管動脈粥樣硬化的發生和發展。過表達miR-649后，AngⅡ誘導的VSMCs細胞增殖、遷移和侵襲能力降低，Cyclin D1和MMP-2蛋白表達降低，而且P21和E-cadherin蛋白表達升高，表明過表達miR-649可抑制AngⅡ誘導的VSMCs細胞增殖、遷移和侵襲。本研究結果還顯示，茯苓提取物作用AngⅡ誘導的VSMCs細胞后，miR-649表達水平升高，抑制miR-649表達逆轉了茯苓提取物對AngⅡ誘導的VSMCs細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，提示茯苓提取物通過上調miR-649表達抑制AngⅡ誘導的VSMCs細胞增殖、遷移和侵襲。

miRNA通常與靶基因的3’UTR靶向結合調控靶基因的表達，進而影響細胞的生物學行為[15]。本研究通過生物信息學軟件預測顯示，Akt1的3’UTR與miR-649的核苷酸序列存在結合位點，并通過雙熒光素酶實驗和檢測Akt1蛋白水平證實了Akt1在VSMCs細胞中靶向負調控Akt1表達。Akt1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與細胞的生長、凋亡等生命活動。韓陽等[16]研究顯示，AngⅡ處理小鼠動脈血管平滑肌細胞后，細胞中Akt磷酸化水平升高。曹學照等[17]研究顯示，腎素前體可通過激活Akt通路誘導血管平滑肌細胞增殖。提示Akt1參與調控血管平滑肌細胞的生物學行為。本研究顯示，AngⅡ刺激可促進VSMCs細胞Akt1和p-Akt1蛋白表達，而茯苓提取物可降低AngⅡ誘導的VSMCs細胞Akt1和p-Akt1蛋白表達，進一步說明茯苓提取物通過上調miR-649表達，通過下調Akt1表達抑制AngⅡ誘導的VSMCs細胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，茯苓提取物可抑制AngⅡ誘導的VSMCs細胞增殖、遷移和侵襲，其作用機制與上調miR-649表達，進而下調Akt1表達有關。這為茯苓提取物治療血管動脈粥樣硬化及心血管疾病的防治提供了一定的實驗依據。