MAP3K14下調miR-17-5p對胰腺癌細胞增殖和凋亡的影響

曹洪慶 劉廣民

胰腺癌是一種高度惡性的消化道腫瘤，胰腺癌的5年生存率為7%～8%，近年來胰腺癌發病率和死亡率逐年上升[1]。因此，對于胰腺癌進行早期診斷，采取積極有效的干預措施阻止胰腺癌的進展是提高患者生存率的關鍵所在。長鏈非編碼RNA(longnon-codingRNA,lncRNA)是長度>200個核苷酸的非編碼RNA，沒有編碼蛋白的功能。研究發現,lncRNA在調節細胞增殖、凋亡、侵襲及血管生成中發揮著重要功能[1]。越來越多的研究表明,lncRNA參與腫瘤細胞的形成和發展。例如,在肺腺癌、前列腺癌、白血病、結腸癌和肝癌組織中均發現lncRNA差異表達[2]。研究發現，lncRNA MALAT1通過靶向調控miR-204表達誘導胰腺癌細胞G2/M細胞周期停滯、促進細胞凋亡,抑制細胞的遷移和侵襲能力[3]。LncRNA-PVT1通過調節miR-448促進胰腺癌細胞的增殖和遷移[4]。LncRNA BCAR4在胰腺癌細胞中表達升高,LncRNA BCAR4的高表達可促進胰腺癌細胞增殖，抑制凋亡[5]。有研究報道lncRNA MAP3K14在胰腺癌組織中下調表達，其可能與胰腺癌的發生發展有關[6]，另外MAP3K14對胰腺癌細胞的生物學行為的影響及具體機制尚不清楚。目前研究已證實絲裂原活化蛋白激酶家族MAPK參與調控腫瘤的發生發展，其中已證明MAP3K10可通過上調gli-1和gli-2的表達促進胰腺癌細胞增殖[7]，MAP3K14可抑制乳腺癌細胞生長和侵襲[8]。因此，本研究就MAP3K14對胰腺癌細胞增殖、凋亡的影響以及是否通過調節miR-17-5p來影響胰腺癌細胞的增殖凋亡進行研究,以期為今后胰腺癌的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI 1640培養基購自美國 Gibco，胎牛血清購于Gibco，Trizol試劑盒購于TakaRA,lncRNA 提取試劑、熒光定量RT-PCR 試劑盒購于Qiagen,試劑 LipofectamineTM 2000、OTI-MEM均購自Invitrogen。miR-MAP3K14引物合成自上海生工生物公司，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于美國Promega，pcDNA3.1、pcDNA3.1-MAP3K14、pcDNA3.1-MAP3K14+miR-NC、pcDNA3.1-MAP3K14+miR-17-5p購自武漢淼靈生物科技有限公司，CCK-8試劑購自美國 Amresco 公司。

1.2 標本收集 55例胰腺癌組織及25例癌旁組織標本，來源于醫院手術治療的患者，在手術前均未采用放療和化療，術后病理診斷是胰腺癌的腫瘤組織和癌旁正常組織的液氮凍存標本。標本的采集均經過患者同意，簽屬知情同意書，并經過醫院倫理委員會審核通過。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養:采用含有胎牛血清為10%的RPMI1640培養液對Panc-1細胞和MIApaca-2細胞進行培養。使其在溫度為37℃、CO2體積分數為5%的細胞培養箱內培養。定期觀察，根據細胞生長狀態更換培養液。當細胞鋪滿瓶底80%左右時，加入胰蛋白酶消化傳代。

1.3.2 細胞轉染及實驗分組:收集對數生長期的人胰腺癌Panc-1、MIApaca-2細胞，并以適當密度接種到6孔板上。于細胞培養箱中培養至細胞融合度約為70%，根據LipofectamineTM2000轉染試劑使用說明書進行轉染，實驗分組：Con組(未進行任何處理的細胞)、pcDNA3.1組(空載體轉染至細胞)、pcDNA3.1-MAP3K14組(MAP3K14過表達載體pcDNA3.1-MAP3K14轉染至細胞)、pcDNA3.1-MAP3K14+miR-NC組(pcDNA3.1-MAP3K14與miR-NC共轉染至細胞)、pcDNA3.1-MAP3K14+miR-17-5p組(pcDNA3.1-MAP3K14與miR-17-5p mimics共轉染至細胞)，轉染6 h 更換為含有10%胎牛血清的RPMI1640培養基，繼續培養48 h后收集細胞。為驗證 MAP3K14對miR-17-5p的靶向調控作用，實驗分組：pcDNA3.1組、pcDNA3.1-MAP3K14組、si-NC組(si-NC轉染至細胞)、si-MAP3K14組(MAP3K14小干擾RNA轉染至細胞)。嚴格按照LipofectamineTM2000轉染試劑說明書進行操作。

1.3.3 Real-time PCR 法檢測RNA的表達:根據Trizol試劑(Invitrogen)盒說明書方法抽提各試驗組總RNA，并測定其濃度。取2 ng 總RNA加入逆轉錄試劑盒(Invitrogen)轉錄成cDNA，加80 μl DEPC稀釋后，放-20℃保存。用SYBR Green I PCR 檢測試劑盒對5 μl cDNA 溶液進行熒光定量PCR，MAP3K14引物序列：上游為5’-ATTTGCTCCTGCTCCTCCAGA-3’，下游為5’-CCAGCCTCCTCCCAGTCTTTC-3’；內參GAPDH引物序列：上游為5’-GTGCTGAGTATGTCGTGGAG-3’，下游為5’-GTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3’；PCR反應條件：95℃ 2 min；95℃ 10 s,60℃ 30 s，70℃ 30 s，共40個循環；解鏈曲線分析：95℃ 1 min，55℃ 30 s；然后緩慢升溫至 95℃，升溫速率為0.2℃/s。采用2-ΔΔCt法分析目的lncRNA的相對表達水平，上述具體操作依試劑盒說明書進行。后續實驗中，miR-17-5p的表達亦采用RT-PCR檢測，其中引物分別為miR-17-5p-F：5′-TGTCAAAGTGCTTACAGTG-3′; miR-17-5p-R：5′-CCATAATGCTACAAGTGCC-3′;U6作為內參,U6-F:5’-GCTTCG GCAGCACATATACTAAAAT-3′; U6-R：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.3.4 CCK-8檢測細胞增殖:取上述對數生長期的各組Panc-1、MIApaca-2細胞，以每孔 2×105個密度種植于96孔細胞板上。培養箱內常規培養，在培養時間截止前2 h加入10 μl CKK-8溶液，放在5% CO2、37℃培養箱中孵育2 h，采用酶標儀檢測各孔在490 nm波長處的吸光度值。

1.3.5 平板克隆實驗檢測細胞克隆數:各組細胞培養48 h后用胰蛋白酶消化成單細胞懸液，接種于細胞培養板中，于37℃培養箱培養2周，當培養皿中出現肉眼可見的克隆時，終止培養。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定15 min，然后去固定液，加適量Giemsa染色10～30 min，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。顯微鏡下計數。

1.3.6 流式細胞術檢測細胞的凋亡:轉染后48 h的細胞用于實驗，消化收集1×104個細胞，加入100 μl PBS和100 μl DNA Prep LPR，孵育10 min后再加1 ml DNA Prep Stain，孵育10 min，流式細胞儀檢測細胞周期:收集1×105個細胞，PBS 洗滌后加入5 μl Annexin緩沖液、5 μl 7AAD、5 μl AnnexinV-PE，避光孵育10 min 后上流式細胞儀分析。

1.3.7 雙熒光素酶報告基因檢測實驗:采用starBase(http://starbase.sysu.edu.cn/)靶基因預測庫檢測到MAP3K14與miR-17-5p存在結合位點。猜測miR-17-5p可能是MAP3K14的一個靶基因。為驗證這一猜想，我們構建了野生型WT-MAP3K14和突變型MUT-MAP3K14的熒光素酶報告載體。參照1.3.3中的方法以LipofectamineTM2000將miR-NC、miR-17-5p分別與WT-MAP3K14和MUT-MAP3K14共轉染，于細胞培養箱中常規培養48 h。收集各組細胞，參照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒操作步驟進行檢測。

2 結果

2.1 MAP3K14在胰腺癌組織中相對低表達 與人正常胰腺組織比較，胰腺癌組織中MAP3K14的表達水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 MAP3K14在胰腺癌組織和正常胰腺組織中的表達

2.2 MAP3K14抑制Panc-1、MIAPaCa-2細胞增殖并促進細胞凋亡 pcDNA3.1-MAP3K14組Panc-1、MIApaca-2細胞中MAP3K14的表達水平明顯高于pcDNA3.1組(P<0.05)，成功構建了MAP3K14過表達的panc-1、MIApaca-2細胞。轉染24 h后，2組細胞的吸光度值差異無統計學意義(P>0.05)，而轉染48 h和72 h后，pcDNA3.1-MAP3K14組的吸光度值較pcDNA3.1組明顯下降(P<0.05)；與pcDNA3.1組比較，MAP3K14過表達后Panc-1、MIAPaCa-2細胞的凋亡數明顯增加(P<0.05)，與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-MAP3K14組Panc-1、MIApaca-2細胞平板克隆數顯著降低(P<0.05)。MAP3K14過表達可抑制Panc-1、MIAPaCa-2細胞的增殖、促進細胞的凋亡。見圖1，表2～4。

圖1 過表達MAP3K14對細胞Panc-1、MIAPaCa-2凋亡的影響

表2 過表達MAP3K14對細胞Panc-1增殖、凋亡的影響

表3 過表達MAP3K14對細胞MIAPaCa-2增殖、凋亡的影響

表4 過表達MAP3K14對細胞Panc-1、MIAPaCa-2平板克隆數的影響

2.3 MAP4K14吸附miR-17-5p，并負向調控其表達 starBase軟件檢測結果，MAP4K14與miR-17-5p之間存在互補結合位點。雙熒光素酶報告基因實驗檢測結果，同miR-NC與WT-MAP3K14共轉染比較，miR-17-5P與WT-MAP3K14共轉染后，Panc-1細胞的熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)；而miR-NC、miR-17-5p分別與MUT-MAP3K14共轉染后，Panc-1細胞的熒光素酶活性差異無統計學意義(P>0.05),可見MAP3K14對miR-17-5p具有靶向作用。與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-MAP3K14組中miR-17-5p表達水平明顯降低(P<0.05)；相反，si-MAP3K14組中miR-17-5p表達水平明顯高于si-NC組(P<0.05)。MAP3K14可負向調控miR-17-5p表達。見圖2，表5、6。

表5 雙熒光素酶報告實驗

圖2 MAP3K14的3’UTR中含有miR-17-5p的互補核苷酸序列

2.4 過表達miR-17-5p能逆轉MAP3K14對胰腺癌細胞增殖、凋亡的影響 24 h作用時間下，pcDNA3.1組、pcDNA3.1-MAP3K14組、pcDNA3.1-MAP3K14+miR-NC組和pcDNA3.1-MAP3K14+miR-17-5p組細胞的增殖能力差異無統計學意義(P>0.05)；48 h和72 h作用時間下，pcDNA3.1-MAP3K14組細胞的增殖能力較pcDNA3.1組明顯減弱(P<0.05)，pcDNA3.1-MAP3K14組與pcDNA3.1-MAP3K14+miR-NC組間差異無統計學意義(P>0.05)，但pcDNA3.1-MAP3K14+miR-17-5p組較pcDNA3.1-MAP3K14+miR-NC組明顯升高(P<0.05)。同時，pcDNA3.1-MAP3K14組細胞的凋亡率能力明顯高于pcDNA3.1組(P<0.05)，pcDNA3.1-MAP3K14+miR-17-5p組明顯低于pcDNA3.1-MAP3K14+miR-NC組(P<0.05)，而pcDNA3.1-MAP3K14組與pcDNA3.1-MAP3K14+miR-NC組間差異無統計學意義(P>0.05)。miR-17-5p過表達可顯著逆轉MAP3K14對胰腺癌panc-1細胞增殖的抑制作用、逆轉對細胞凋亡的促進作用。見表7。

表6 MAP3K14對miR-17-5p表達的影響

表7 過表達miR-17-5p能逆轉MAP3K14對胰腺癌細胞增殖、凋亡的影響

3 討論

胰腺癌的惡性程度非常高，它具有起病隱匿、手術切除率小、預后不良、病死率高、生存率低等特點。目前根本的治療原則依然是以外科治療為主，放化療為輔。手術是唯一可能根治的方法，但因胰腺癌的早期診斷困難，易早期發生侵襲轉移，故手術切除率低、預后不良、術后生存率低。放化療是腫瘤綜合治療中的重要環節，但胰腺癌對化療藥的反應程度不明顯，對放療不敏感，故對于延長晚期胰腺癌患者的生存時間作用有限。

長鏈非編碼RNA(longnon-codingRNA,lncRNA)其本身不編碼蛋白，但研究發現它們在多種層面實現對基因的調控，將類似功能歸納為轉錄調控、轉錄后調控和表觀遺傳學調控3個主要層面[9]。LncRNA的表達或功能異常與人類眾多疾病的發生密切相關,如癌癥、阿爾茲海默癥、糖尿病等，具體表現為LncRNA在序列、空間結構、表達水平及與結合蛋白相互作用上的異常等。研究發現LncRNA與人類多個腫瘤的發病聯系密切，可以在多個水平參與基因表達調控網絡的構成，調控腫瘤的發生、發展，并與腫瘤的侵襲、轉移及患者預后聯系密切[10]，其有望成為潛在的診斷標志物和治療的靶點。有研究證明，長鏈非編碼RNA MAP3K14在胰腺癌組織中下調表達,MAP3K14屬于絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)超級家族，能介導刺激信號從細胞膜傳遞到細胞核或其他胞內靶點，能夠調節細胞的增殖、分化、細胞周期和凋亡等[11]；本研究通過RT-PCR法檢測到胰腺癌組織中MAP3K14的表達較正常胰腺組織顯著下調，通過過表達胰腺癌細胞中MAP3K14，發現MAP3K14能抑制胰腺癌細胞的增殖，促進細胞凋亡，證實MAP3K14是抑癌基因，但MAP3K14對胰腺癌細胞的生物學行為的具體機制尚不清楚。相關研究發現,lncRNA可以通過穩定某些抑癌基因的mRNA以及蛋白來促進癌細胞的生長發育及轉移[12]，且在生物中,lncRNA 和miRNA往往是共同作用的,它們之間可以協同調節,也存在相互調節[13]。有研究發現miR-17-5p為癌基因在胰腺癌細胞中上調表達可促進癌細胞增殖、遷移[14]。miRNA是內源性非編碼短鏈 RNA，在轉錄后水平調節血管生成及細胞周期、凋亡、侵襲和遷移等腫瘤相關基因的表達，進一步影響腫瘤細胞的增殖、轉移和侵襲[15]，所以我們猜測MAP3K14可能是通過調控miR-17-5p的表達來影響胰腺細胞的增殖、凋亡。我們采用雙熒光素酶報告基因實驗驗證發現miR-17-5p的3’UTR上存在MAP3K14的互補結合序列。通過過表達胰腺癌Panc-1細胞中的MAP3K14，發現 miR-17-5p的表達量相對下降，沉默MAP3K14的表達，miR-17-5p的表達量相對上升，證實MAP3K14可負向調控miR-17-5p的表達，再進一步研究，通過過表達胰腺癌Panc-1細胞中miR-17-5p，發現miR-17-5p可以逆轉MAP3K14對胰腺癌細胞增殖、凋亡的影響。表明MAP3K14通過下調miR-17-5p的表達來抑制胰腺癌細胞的增殖、促進細胞凋亡。

胰腺癌的發生發展是一個很復雜的過程，是多因素共同參與、多基因協同作用、綜合發展的結果[16]，因此找到有效的診斷新方法是提高胰腺癌治療效果的關鍵所在。通過深入研究MAP3K14在胰腺癌發生、發展中的作用，有可能從另一方面揭示胰腺癌的發病機制，為胰腺癌診斷提供新的生物標志物，為胰腺癌的治療提供新靶點，以期抑制癌癥的復發和轉移，提高臨床療效。