多重PCR與恒溫擴增芯片法在呼吸道病原體中的檢測價值

邸紅芹 安曉穎 張輝 高艷君 陳寧 劉戰地

呼吸道感染是常見多發流行病，具有來源復雜，感染力強，感染發病急，潛伏期短，傳播快等特點，嚴重威脅著人們的健康和生活質量。不同的呼吸道病原體感染，其臨床癥狀極為相似，尤其是在不明原因呼吸道疾病爆發時，有效、快速的鑒別患者感染呼吸道病原體的類型對臨床早期診斷和治療至關重要。傳統的呼吸道病原體檢測方法主要是細菌培養和血清學檢測，由于其操作復雜、檢測靈敏度低且檢測時間長無法滿足快速診斷的要求。近年來分子生物學技術以其高敏感度、高特異度且操作快速簡便等優點，已經成為快速診斷呼吸道病原體的首選方法[1-3]，且多重病原體檢測系統也越來越普及，博奧生物呼吸道病原菌核酸檢測為國內運用較多的呼吸道病原體檢測試劑盒，是一種基于恒溫擴增微流控芯片技術，利用鏈置酶(Bst酶)在恒溫(65℃)條件下進行反應和實時熒光分析，一步完成對靶基因的擴增和檢測，簡單易行[4]。本研究采用多重PCR檢測體系[5]和恒溫芯片法檢測呼吸道病原體核酸，比較兩種方法對呼吸道病原體的檢測效能，評估多重PCR體系在呼吸道病原體診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院2017年1月至2017年5月診斷為下呼吸道感染或肺炎的新入院患者，符合以下癥狀：出現咳嗽、咳痰、痰液粘稠，肺部出現濕啰音并伴有發熱或白細胞總數和嗜中性粒細胞比例增高等。共收集合格痰液標本123例，其中男81例，女42例；年齡16～88歲，平均年齡(49.55±6.51)歲。痰合格標準：白細胞數>25/低倍視野且上皮細胞<10/低倍視野，樣本量≤0.6 ml，置于樣本收集管內，立即保存于4℃冰箱，24 h內檢測，未及時檢測的樣本于-70℃冰箱保存。

1.2 試劑和儀器 Ⅱ級生物安全柜(esco，型號LB2-4B1)；低溫高速離心機(艾本德型號5424R)；全自動實時熒光定量PCR儀(美國伯樂，型號CFX96 Deep Well)；全自動核酸提取儀(德國凱杰，型號QIAcube connect)；核酸提取試劑盒(QIAamp DNA Mini Kit，德國凱杰生物公司)；恒溫擴增芯片核酸分析儀(RTisochip-A，博奧生物)；微量移液器(德國艾本德公司)；呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒(恒溫芯片法，博奧生物，貨號302010)。

1.3 菌株來源 呼吸道病原體菌株來源于實驗室標準菌株以及本院檢驗科微生物室分離培養，包括銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa，Pae)、肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae，Spn)、金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus，Sau)、肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae，Kpn)、結核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)、流感嗜血桿菌(haemophilus influenzae，Hin)。整個過程按照國家傳染性病原體的安全操作規范進行。

1.4 核酸提取 痰液標本采用消化液(4% NaOH溶液)消化15～30 min至痰液呈水樣，若消化不完全可適當延長消化時間，采用DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Mini Kit，Qiagen，Germany)，根據試劑盒提取說明書，采用全自動核酸提取儀提取核酸，提取的核酸立即檢測，若24 h內能檢測置于-20℃冰箱保存，若長期保存需置于-70℃冰箱。

1.5 恒溫擴增芯片法檢測 采用呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒(恒溫擴增微流控芯片法)，根據說明書配制擴增試劑，體系如下：20 μl檢測緩沖液(包含檢測引物及酶液等)和36.5 μl呼吸道病原體核酸，渦旋震蕩，瞬時離心之后加入檢測芯片，上機檢測，反應程序如下：37℃ 3 min，65℃ 1 min(采集熒光信號)，擴增45個循環。

1.6 多重PCR檢測 參照邸紅芹等[5]構建的呼吸道多重PCR擴增體系進行檢測，反應體系如下：反應液(Taqman Fast Virus One-step Master Mix，Invitrogen)13.5 μl，各引物/探針(終濃度為0.4 μmol/L)1.5 μl以及10 μl核酸。然后將各反應管按以下程序在實時熒光PCR儀(Roche 480)上進行PCR反應：50℃，15 min(逆轉錄反應)；95℃，10 min(熱啟動)；95℃，15 s(變性)，60℃，45 s(退火/延伸，采集熒光信號)，擴增35個循環。

1.7 結果判定 PCR擴增結束后，使用熒光定量PCR儀自帶軟件進行結果分析，所有陰性樣本的信號值都應低于閾值；當Ct值>35時，樣本低于檢測閾值線，結果判定為呼吸道病原體核酸陰性；當Ct值≤35時，結果判定為呼吸道病原體核酸陽性。恒溫擴增芯片法擴增陽性的樣品會產生類似實時熒光的“S”形擴增曲線，進一步完成對靶基因的擴增和檢測，每張芯片內均設有1個陽性質控和9個陰性質控，采用ROC法計算得到待檢病原菌的陽性判斷值，通過檢測軟件自動判讀，當檢測指標的Tp值≤該指標的陽性判斷值且陽性質控和陰性質控均正常時，判讀為呼吸道病原體核酸陽性；當檢測指標的Tp值>該指標的陽性判斷值且陽性質控和陰性質控均正常時，判讀為呼吸道病原體核酸陰性。

2 結果

2.1 檢測結果判定 PCR擴增結束后，采用機器自帶軟件進行擴增圖片分析，相應的檢測通道顯示各類呼吸道病原體核酸擴增結果，以流感嗜血桿菌(HIN)核酸擴增檢測為例，呈“S”型擴增曲線，陰陽性質控都在控，顯示檢測有效。見圖1。

圖1 呼吸道病原體核酸檢測擴增曲線；A多重熒光定量PCR法檢測流感嗜血桿菌核酸擴增曲線；B恒溫芯片法檢測流感嗜血桿菌核酸擴增曲線，紅色曲線為擴增曲線，另外兩條擴增曲線為外質控和陽性對照

2.2 多重熒光定量PCR法性能評估 采用多重熒光定量PCR法和恒溫芯片法同時對呼吸道病原體標準菌株(包括銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、結核分枝桿菌、流感嗜血桿菌)進行檢測，以恒溫芯片法檢測為金標準，結果顯示多重熒光定量PCR法各個檢測通道無相互干擾，具有很高的一致性和特異性。見表1。

表1 多重熒光定量PCR與恒溫芯片法一致性和特異性分析

2.3 臨床樣本檢測結果分析 多重熒光定量PCR法和恒溫芯片擴增法同時對123例呼吸道疾病患者痰液標本檢測結果顯示，恒溫芯片法檢出陽性率為43.09(53/123)，多重熒光定量PCR法檢出陽性率為47.15%(58/123)，差異無統計學意義(χ2=0.410，P=0.522)。多重熒光定量PCR法與恒溫芯片法對常見呼吸道病原體如：銅綠假單胞菌(χ2=0.200，P=0.655)、肺炎鏈球菌(χ2=0.063，P=0.802)、金黃色葡萄球菌(χ2=0.063，P=0.802)、肺炎克雷伯菌(χ2=0.048，P=0.827)、結核分枝桿菌(χ2=0.478，P=0.689)、流感嗜血桿菌(χ2=0.185，P=0.667)的檢測結果顯示，多重熒光定量PCR法和恒溫芯片擴增法的檢出率差異無統計學意義(P>0.05)。一致性分析顯示多重熒光定量PCR法和恒溫芯片擴增法對常見呼吸道病原體檢測，包括：銅綠假單胞菌(Kappa=0.900)、肺炎鏈球菌(Kappa=937)、金黃色葡萄球菌(Kappa=0.937)、肺炎克雷伯菌(Kappa=0.952)、結核分枝桿菌(Kappa=0.854)及流感嗜血桿菌(Kappa=0.908)均具有高度一致性(Kappa均>0.75)。見表2。

表2 多重熒光定量PCR與恒溫芯片法對呼吸道病原體檢出比較

3 討論

引起呼吸道感染的病原體種類多且癥狀大多相似，臨床醫生很難準確診斷病因，因此，快速、準確檢測出患者所感染的呼吸道病原體尤為重要。近年，適用于檢測病原體的分子生物學技術不斷涌現，核酸檢測技術由于其高敏感性、便捷性和簡便性，越來越多的用于臨床實驗室呼吸道病原體的常規診斷，如熒光定量PCR[6-8]、恒溫擴增技術[9-12]以及芯片技術[13-15]、測序技術[16-18]等。呼吸道病原體的高通量檢測也越來越普及，其中比較常用的有多重熒定量PCR法、恒溫微流控芯片法以及測序法。徐嘉楠等[19]運用多重PCR技術聯合熔解曲線(Tm)快速檢測并區分22種呼吸道感染相關的病原體，結果顯示這種基于多重PCR技術的檢測試劑盒不僅極大縮短檢測時間，得到較高的陽性率，且其操作技術也較常規方法更簡便；李艷燕等[20]采用基于環介導等溫擴增技術(LAMP)結合微流控芯片，進行13種常見下呼吸道病原體檢測，該方法簡單快速、試劑耗量低、自動化程度高，提高了檢測敏感性，具備了對呼吸道感染性疾病的快速診斷能力，極大縮短了檢驗周期。呂園等[21]對13種呼吸道病原體多重檢測試劑(PCR毛細管電泳片段分析方法)進行性能驗證，證實該試劑盒滿足交叉反應、符合率及抗干擾能力等要求，可用于臨床呼吸道樣本的檢測。可見核酸檢測技術的應用將成為廣譜呼吸道病原體檢測的新方向。

本研究將多重PCR與熒光定量PCR相結合建立多重熒光定量PCR(MRT-PCR)體系，針對呼吸道病原體核酸序列的保守區設計特異性引物和熒光探針，同時綜合兩種檢測方法的優點能夠快速、高通量的檢測常見的呼吸道病原體[5]。以恒溫芯片法為參照[22，23]，一致性分析顯示多重熒光定量PCR體系間各檢測通道干擾，具有很高的特異性(表1)。同時，對123例呼吸道疾病患者痰液標本檢測結果顯示，恒溫芯片法檢出陽性率為43.09%(53/123)，多重熒光定量PCR法檢出陽性率為47.15%(58/123)，差異無統計學意義(χ2=0.410，P=0.522)，顯示多重熒光定量PCR可用于呼吸道病原體的檢測。

本研究對兩種方法的操作簡便性和時效性進行比較，兩種方法樣本處理及核酸提取的過程相同，結果判讀都是根據Ct值。恒溫芯片檢測試劑盒一次能同時檢測13種病原體，但每次只能檢測1個樣本；多重熒光定量PCR法一次能同時檢測15種病原體，每次檢測量依據PCR儀的通量而定，每份樣本需要1個八聯排PCR管。操作步驟方面，恒溫芯片檢測試劑盒操作較簡便，僅需一步操作即可完成；而多重熒光定量PCR需要配置多個試劑盒，需要手工操作的步驟比較多。儀器要求方面，恒溫芯片檢測試劑盒完成所有病原體的檢測需要相應的恒溫檢測儀，1 h以內即可完成，但如果需要同時檢測多個樣本，則需要增加儀器的數量；多重熒光定量PCR法需要PCR儀，2.5～3 h完成檢測，儀器越多或通量越大檢測樣本數量越多。因此，在實際應用中，可根據實際情況來選擇合適的檢測方法。

本研究將與恒溫芯法檢測試劑盒共有的7種常見呼吸病原體：銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、軍團菌、結核分枝桿菌、流感嗜血桿菌進行檢測性能分析。多重熒光定量PCR法和恒溫芯片法對銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、結核分枝桿菌、流感嗜血桿菌的陽性檢出分別為12例(9.76%)、9例(7.32%)、8例(6.50%)、11例(8.94%)、22例(17.89%)、11例(8.94%)和10例(8.13%)、8例(6.50%)、9例(7.32%)、12例(9.76)、18例(14.63%)、13例(10.57%)，同時對陽性檢出進行統計學分析，差異無統計學意義(P>0.05)，一致性分析Kappa值顯示兩種檢測方法具有高度一致性(Kappa>0.75)。本研究因未評估多重熒光定量PCR體系中其他病原體如流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒以及冠狀病毒的檢測性能，具有一定的局限性，同時增加樣本量并應采用更多相似的商品化檢測試劑盒進行進一步地性能驗證。

綜上所述，構建多重熒光定量PCR體系與恒溫芯片檢測法對常見呼吸道病原體的檢測敏感性和特異性相近，可用于快速、高通量篩查多種呼吸道病原體，具有良好的應用前景。