四神丸對腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠及離體結(jié)腸的實驗研究＊

劉 敏，薛 紅，胡運蓮

（1. 三亞市人民醫(yī)院 三亞 572000；2. 中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院 北京 100091；3. 湖北省中醫(yī)院 武漢 430030）

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一種常見的功能性腸道病變，因應(yīng)激事件誘發(fā)，主要表現(xiàn)為腹痛、腹脹、腹瀉、便秘等癥狀，國際通常依照出現(xiàn)腹瀉或者便秘將IBS 分為四型（腹瀉型、便秘型、混合型和不定型），在我國腹瀉型腸易激綜合征（IBS with predominant diarrhea，IBS-D）患者較多，占到整個IBS 發(fā)病率的66.3%[1,2]。IBS-D 常常反復(fù)發(fā)作，由于缺乏理想的藥物治療，對患者的生活質(zhì)量造成很大影響，因此亟需療效確切的治療藥物。

四神丸最早見于宋·陳文中所著的《陳氏小兒痘疹方論》，由補骨脂、肉豆蔻、吳茱萸、五味子、大棗和生姜組成，是治療脾腎陽虛泄瀉的經(jīng)典方。中醫(yī)認為腎陽虧虛，脾失溫煦，運化失司，發(fā)為泄瀉是IBS-D 的病機變化特點[3]，因此四神丸的藥性契合IBS-D 的病機，文獻也顯示以四神丸為基礎(chǔ)方的加減治療IBS-D臨床療效較佳[4,5]。由于缺乏較好的IBS-D動物模型和評價方法，IBS-D 的發(fā)病和病理生理變化還有待深入探究，目前四神丸對IBS-D 的藥理作用特點和作用機制還不清楚[6]。近來有文獻報道了改良的IBS-D 動物模型和評價方法，也發(fā)現(xiàn)IBS-D 發(fā)生與胃腸道動力調(diào)節(jié)失衡密切相關(guān)[7,8]。本研究擬采用母子分離聯(lián)合慢性束縛應(yīng)激和番瀉葉灌胃法建立IBS-D 大鼠模型評價四神丸的作用效應(yīng)，并通過觀察四神丸對離體結(jié)腸動力作用來揭示四神丸的作用機制，為四神丸臨床應(yīng)用治療IBS-D提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF 級SD 孕鼠10 只，孕期（18 ± 2）天，由思科貝（北京）生物技術(shù)有限公司提供，合格證編號：SCXK（京）2016-0002。造模全部使用新生雄鼠（飼養(yǎng)地點：湖北中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心；飼養(yǎng)條件：Ⅱ級，室溫22-25℃，相對濕度45%-60%，自由進食、飲水。

1.2 試劑和藥物

四神丸，北京同仁堂天然藥物（唐山）有限公司，批號17090012，規(guī)格：27 g/瓶，研碎后過篩，用蒸餾水配制成0.72 g·mL-1、0.36 g·mL-1、0.18 g·mL-1的混懸液用于灌胃，放入4℃冰箱，備用。匹維溴銨片，法國蘇威制藥公司，規(guī)格: 50 mg/片，研碎后過篩，配制成1.5 mg·mL-1的藥液備用。番瀉葉（湖北中醫(yī)藥大學(xué)湖北省中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供并進行質(zhì)量鑒定），水煎過濾濃縮成1g 生藥/mL 的藥液。其他試劑均由Sigma-Aldrich中國公司提供。

1.3 儀器

自制大鼠束縛網(wǎng)和帶氣囊的腸壁增壓管（可通過三通管測定壓力）；BIOPAC 生理記錄儀采集系統(tǒng)（美國BIOPAC公司）；張力換能器（成都儀器廠）。

2 方法

2.1 模型制備與分組

選擇由孕鼠生出的90 只SD 雄性乳大鼠，選取15只作為對照組，其余75 只參照文獻[7,8]建立IBS-D 大鼠模型，將造模乳鼠從出生第2 天始每天上午與母鼠分開3 h，進行2周，對照組母子同籠。所有乳鼠出生3周后皆斷奶并與母鼠分開放置，至大鼠體重達180 g 以上（大約7-8 周）后，采用自制束縛架對造模大鼠固定時間進行制動束縛3 h，連續(xù)3周（對照組不束縛）。造模大鼠在束縛應(yīng)激第2周結(jié)束后開始給與番瀉葉水煎劑（1 g·kg-1）灌胃，進行2 周，在此期間將造模動物隨機分為模型組、中藥組（SSW 高劑量組，SSW 中劑量組，SSW 低劑量組）、陽性藥（匹維溴銨）組，在疊加番瀉葉灌胃的同時，四神丸高、中、低劑量組動物每日按7.2 g·kg-1、3.6 g·kg-1、1.8 g·kg-1灌胃（分別相當(dāng)于成人等效劑量的4、2、1倍），匹維溴銨組按15 mg·kg-1（相當(dāng)于成人等效劑量的2 倍），連續(xù)灌胃4 周。模型組和對照組灌胃等量生理鹽水。離體腸管實驗直接將混懸液進行稀釋后使用。

2.2 內(nèi)臟高敏感性的測定

異氟烷氣體麻醉后，將涂石蠟油的帶氣囊的增壓管插入肛門約6 cm，固定在尾根部，并把實驗大鼠限制于透明盒中，待動物清醒后，對球囊充氣模擬腸道對機械刺激的敏感性，造成直腸擴張而引發(fā)大鼠腹壁逃避反射（abdominal withdrawal reflex，AWR），實驗按照20、40、60、80 mmHg 四個壓力值進行加壓，每4 min加壓20 s，每個壓力值重復(fù)觀察3 次，取平均值作為AWR 分值。AWR 分值的積分標(biāo)準(zhǔn)：0 分，未見明顯變化；1 分，出現(xiàn)扭動頭部等輕微不安變化，腹背部肌肉未見收縮；2 分，出現(xiàn)腹背部肌肉收縮，腹部未抬離地面；3分，出現(xiàn)腹背部肌肉較收縮，腹部抬離地面；4分，腹背部肌肉收縮，腹部呈弓狀彎曲，腹部抬離地面。將AWR評分為3分時的壓力閾值作為疼痛閾值。

2.3 糞便粒數(shù)和腹瀉指數(shù)

單獨放置大鼠，在固定時間籠內(nèi)放置濾紙，保存4 h，記錄每只大鼠糞便粒數(shù)，排稀便次數(shù)、糞便污跡的直徑等腹瀉情況，并計算腹瀉指數(shù)（稀便率×平均稀便級）。稀便率是指每只大鼠所排稀便數(shù)（污跡數(shù)）與總便數(shù)（糞便粒數(shù)+污跡數(shù)）之比；稀便級是指稀便污跡面積的大小，按照污跡直徑分為四級：＜1 cm 為一級，1-2 cm 為二級，2-3 cm 為三級，＞3 cm 為四級。平均稀便級=稀便級數(shù)總和/污跡數(shù)。

2.4 大鼠離體腸管實驗

取15 只雄性成年大鼠，實驗前禁食24 h，不禁水，脫頸后處死，取肛門遠側(cè)3-5 cm 左右的結(jié)腸，剪成1.5 cm 小段，去除聯(lián)結(jié)的系膜和脂肪，洗凈腸管，放入Tyrode 液（NaCl 136，KCl22，CaCl21.8，MgCl21，NaHCO312，NaH2PO40.6，Glucose 5，HEPES 10，mmol·L-1pH =7.4）浴槽中，將2 個三角形金屬鉤各一邊穿過腸管，其中1 個固定浴槽底部，另1 個連接張力換能器，給予1.5 g 前負荷，穩(wěn)定90 min，每隔15 min 換Tyrode 液，浴槽內(nèi)溫度維持在（37 ± 0.5）℃，持續(xù)通入95%O2和5%CO2混合氣，張力換能器連接到BIOPAC 生理記錄儀采集系統(tǒng)。首先觀察SSW 對腸管自發(fā)收縮作用的影響：等待腸管穩(wěn)定后，累積加入不同濃度SSW 混懸液（0.375-6 g·L-1），觀察大鼠腸管的張力反應(yīng)；然后觀察SSW 對乙酰膽堿所致腸管收縮作用的影響：待腸管平穩(wěn)后向浴槽內(nèi)加入氯化乙酰膽堿（終濃度100 mmol·L-1），穩(wěn)定后向浴槽內(nèi)累積加入不同濃度的SSW混懸液，觀察大鼠腸管的張力反應(yīng)；最后觀察SSW 對高鉀所致腸管收縮作用的影響：待腸管平穩(wěn)后向浴槽內(nèi)加入無鈣高鉀Tyrode 液（正常Tyrode 液中的KCl 提高為60 mmol·L-1，并去除CaCl2），平穩(wěn)后加入高鈣高鉀Tyrode 液（正常Tyrode 液中的KCl 提高為60 mmol·L-1，CaCl2提高為100 mmol·L-1），穩(wěn)定后向浴槽內(nèi)累積加入不同濃度的SSW 混懸液（0.375-6 g·L-1），觀察大鼠腸管的張力反應(yīng)。采用收縮抑制率反映藥物引起的張力變化，計算公式如下：收縮抑制率（%）=（T2 -T0）/（T1 - T0）×100%，其中T0表示基礎(chǔ)張力值，T1表示Ach 或高鉀加入后張力值，T2表示SSW 加入后張力值。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般狀態(tài)

束縛前，各組大鼠狀態(tài)良好，自主活動活躍皮毛有光澤，眼角無分泌物，耳廓呈淡粉色，大便干稀適中。束縛造模的3 h內(nèi)排便量減少，而在束縛期最后1周，給予番瀉葉灌胃后，模型組和給藥組都很快出現(xiàn)稀便，造模結(jié)束后，對照組大鼠自主活動活躍，皮毛光潔，排便未見異常，模型組大鼠狀態(tài)差，自主活動減少，抓取時反抗減弱，無光澤，眼角有分泌物，耳廓色淡，稀便明顯增加，給藥各組動物一般狀態(tài)較模型組略好。各組實驗大鼠部分脫落。

3.2 四神丸對IBS-D模型大鼠內(nèi)臟敏感性的影響

與正常組比較，模型組大鼠對20 mmHg 壓力下的AWR 評分和痛覺閾值具有顯著差異（P＜0.05），提示模型組大鼠腸道痛覺敏感性增高。但是20 mmHg 以上壓力下的AWR 評分無論正常組和模型組都明顯提高，無顯著差異（P＞0.05），提示高壓力下的AWR評分對評價腸管的痛覺敏感性的意義較差。與模型組比較，SSW 低、中、高劑量組及匹維溴銨組痛覺壓力閾值均明顯升高且差異顯著（P＜0.01）。SSW 中、高劑量組及匹維溴銨組在低壓力下（20 mmHg 和40 mmHg）的AWR 評分也表現(xiàn)出明顯差異（P＜0.05），提示四神丸可提高IBS-D模型大鼠腸道痛覺敏感性（表1）。

表1 四神丸對IBS-D模型的AWR評分的影響

3.3 四神丸對IBS-D模型大鼠腹瀉的影響

與正常組比較，模型組大鼠糞便粒數(shù)出現(xiàn)明顯增高（P＜0.01），而且糞便粒明顯變軟，并且出現(xiàn)稀便。與模型組比較，SSW 低、中、高劑量組及匹維溴銨組糞便粒數(shù)和腹瀉指數(shù)均明顯降低（P＜0.01或＜0.05），提示四神丸可減輕IBS-D模型大鼠的腹瀉（表2）。

表2 四神丸對IBS-D模型的糞便粒數(shù)和腹瀉指數(shù)的影響

3.4 四神丸對離體腸管的影響

平衡后可見離體腸管自發(fā)收縮舒張，加入梯度濃度SSW 混懸液（0.375-6 g·L-1）后，結(jié)腸自發(fā)收縮張力曲線未見明顯變化。平衡后加入M 受體激動劑氯化乙酰膽堿（Ach）（終濃度10-4mol·L-1），可見張力明顯增加，可維持20 min 未見明顯變化。進入平臺期后按累加濃度法加入SSW 混懸液（0.375-6 g·L-1），每個濃度作用5 min 后加入下一濃度。SSW 混懸液在1.5-6 g·L-1可呈劑量依賴性的減弱乙酰膽堿造成的腸管張力增加，圖1A 顯示一例SSW 對Ach 預(yù)收縮腸管呈劑量依賴性舒張作用張力變化圖，計算各個濃度的收縮抑制率，建立濃度舒張效應(yīng)曲線（圖1B）。其中1.5 g·L-1，3 g·L-1，6 g·L-1對Ach 收縮作用的收縮抑制率分別為（80.7 ± 10.4）%（n= 7），（52.5 ± 13.9）%（n= 8），（34.7 ± 16.8）%（n= 6），與相同時間點未加入SSW 比較差異顯著（P＜0.01）。平衡后加入無鈣高鉀Tyrode液可見自主舒縮減弱，重新平衡后加入高鈣高鉀Tyrode 液，可見張力明顯增加，20 min內(nèi)張力逐漸減弱至初始張力的70%以內(nèi)，按累加濃度法加入SSW 混懸液（0.375-6 g/L），每個濃度作用5 min 后加入下一濃度。SSW 混懸液在0.75-6 g·L-1可呈劑量依賴性的減弱高鉀造成的腸管張力增加，圖2A 顯示一例SSW 對高鉀預(yù)收縮腸管呈劑量依賴性舒張作用張力變化圖，計算各個濃度的舒張率，建立濃度舒張效應(yīng)曲線（圖2B）。其中0.75 g·L-1，1.5 g·L-1，3 g·L-1，6 g·L-1對高鉀收縮作用的收縮抑制率分別為（72.6±4.1）%（n=8），（29.4±16.6）%（n=7），（11.2±10.8）%（n=8），（7.1±10.5）%（n=8），與相同時間點未加入SSW 比較差異顯著（P＜0.01）。

圖1 SSW對Ach預(yù)收縮腸管量效曲線

圖2 SSW對高鉀預(yù)收縮腸管量效曲線

4 討論

腹瀉型腸易激綜合征是臨床常見的消化內(nèi)科疾患，其臨床主要表現(xiàn)為晨起形寒肢冷，腹痛腹瀉，得溫痛減，并可伴有腰膝酸軟等癥狀，該病發(fā)病因素復(fù)雜，具體機制目前尚不完全清楚，大量文獻報道可能與腦－腸軸雙向調(diào)節(jié)功能紊亂、腸道菌群紊亂、胃腸動力學(xué)失調(diào)、內(nèi)臟高敏感性等多種因素有關(guān)[9]。中醫(yī)臨床認為IBS-D 可能與脾胃運化功能失調(diào)有關(guān)，雖然病位在腸，但是涉及肝脾腎三臟，主要表現(xiàn)為脾腎陽虛。作為治療脾腎陽虛泄瀉的名方四神丸能夠溫腎暖脾，澀腸止瀉，用于脾腎虛寒，五更泄瀉，久泄不止等病癥的治療，近來的文獻報道以四神丸為基礎(chǔ)方對腹瀉型腸易激綜合征的治療優(yōu)于其他中西藥物[10-11]，但目前四神丸整體方劑的藥理學(xué)研究相對較少，原因可能是還缺乏一致公認的IBS 動物模型[12]，而制備良好的IBS動物模型是研究發(fā)病機制、病理生理、藥物治療等方面的基礎(chǔ)。有報道采用慢性不可預(yù)知輕度應(yīng)激聯(lián)合番瀉葉浸劑灌胃造模符合IBS-D 證型特點，是一種較好的造模方式[13]。本研究采用母子分離聯(lián)合慢性束縛應(yīng)激造成不可預(yù)知輕度應(yīng)激并聯(lián)合番瀉葉灌胃法制備IBS-D 大鼠模型，結(jié)果顯示模型大鼠的腸道敏感性和腹瀉狀況均高于正常組，顯示這種造模方法能夠反應(yīng)IBS-D 的臨床特點，可以應(yīng)用與對IBS-D 的深入研究。不同劑量的SSW 和陽性對照藥匹維溴銨治療4 周后，模型大鼠的痛覺壓力閾值明顯升高，而糞便粒數(shù)及腹瀉指數(shù)均明顯下降，說明四神丸能夠從排便功能和內(nèi)臟敏感性兩個方面改善IBS-D 的病理生理異常，且具有濃度依賴性。但是在使用評價內(nèi)臟敏感性指標(biāo)AWR 評分時我們發(fā)現(xiàn)低壓力下（20 mmHg上下）AWR評分變化比較顯著，高壓力下的AWR評分對評價腸管的痛覺敏感性的意義較差。只有聯(lián)合應(yīng)用AWR 評分和痛覺壓力閾值2個指標(biāo)，才能有效評價大鼠內(nèi)臟敏感性的改變。

既往研究發(fā)現(xiàn)IBS-D 患者在空腹和進食后乙狀結(jié)腸動力指數(shù)較正常人明顯增高，而且移行性高幅收縮波的波幅及持續(xù)時間也異于正常人，肌肉松弛劑可有效改善IBS 患者腹痛癥狀[14,15]，表明IBS-D 發(fā)病過程中出現(xiàn)的腹瀉和腹痛可能與腸道平滑肌功能紊亂造成張力異常密切相關(guān)，提示調(diào)節(jié)腸道平滑肌的張力異常有可能改善IBS-D 的癥狀。有研究表明四神丸對家兔離體腸管的自發(fā)活動有明顯的抑制作用而且能夠?qū)笲aCl2引起的腸道平滑肌痙攣，提示四神丸可能通過調(diào)節(jié)腸道平滑肌的張力發(fā)揮藥效[16]。為進一步探究四神丸對腸道平滑肌張力的調(diào)節(jié)作用機制，本實驗應(yīng)用電生理技術(shù)觀察了藥物對正常大鼠離體結(jié)腸腸管的舒縮功能的影響，結(jié)果顯示四神丸僅對乙酰膽堿或高鉀刺激的腸管痙攣性收縮具有濃度依賴性的抑制效應(yīng)，對正常的自發(fā)性舒縮無明顯影響，表明四神丸對正常狀態(tài)的腸功能影響相對較小，對收縮亢進腸管產(chǎn)生緩解作用。Ca2+是腸道平滑肌的興奮-收縮偶聯(lián)者，細胞內(nèi)Ca2+的增加可引起腸道平滑肌收縮。作為平滑肌內(nèi)興奮傳遞的化學(xué)遞質(zhì)乙酰膽堿能夠激動平滑肌細胞表面的M 膽堿能受體，一方面啟動受體依賴型Ca2+通道（RDC），另一方面活化磷酸酯酶C，提高使三磷酸肌醇的含量而啟動受體操縱型Ca2+通道（ROC），來增加腸管的收縮幅度和張力。高鉀溶液可以引發(fā)電壓依賴性的鈣通道開放，引起外鈣內(nèi)流而促進內(nèi)鈣釋放引發(fā)平滑肌收縮[17]。四神丸對Ach 和高鉀刺激的腸管痙攣性的拮抗作用表明該藥可能既能通過抑制內(nèi)鈣釋放又能拮抗外鈣內(nèi)流緩解腸管的異常收縮。最近的報道顯示四神丸可能通過保護腸道黏膜屏障、抑制炎癥反應(yīng)、改善胃腸道運動、消化系統(tǒng)的分泌功能紊亂和腸道內(nèi)敏感性來達到治療腹瀉型腸易激綜合征的作用[18,19]，提示四神丸可通過多種途徑發(fā)揮作用，但具體機制有待進一步研究。

總之，四神丸可能通過其有效成分抑制腸道平滑肌細胞的內(nèi)鈣釋放和拮抗外鈣內(nèi)流2種途徑拮抗腸道的張力異常，改善腸痙攣引起的內(nèi)臟敏感性增高和腸功能亢進引發(fā)的腹瀉。本研究為四神丸治療IBS-D提供了藥理學(xué)依據(jù)。