杜仲葉提取物所含四種主要成分體外抗非酒精性脂肪肝活性研究＊

蔡丹紅，薛 梅，李 玉，朱思睿，劉笑利，張 良

（南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院/江蘇省中藥藥效與安全性評價重點(diǎn)實驗室 南京 210023）

1 介紹

非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除酒精和其他明確損肝因素外所致的肝細(xì)胞內(nèi)以脂肪過度累積（脂肪變性）為主要特征的臨床病理綜合征[1]。隨著生活水平的提高，該病在全球呈流行趨勢。截止2018年，全球NAFLD 患病率為25.24%，而我國NAFLD 的患病率為20.09%，其已成為威脅人類健康的一大因素[2]。NAFLD 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前NAFLD經(jīng)典的“二次打擊學(xué)說”被人們廣泛接受，“第一次打擊”是大量脂質(zhì)在肝臟細(xì)胞內(nèi)過度積累。這個累積過程與胰島素抵抗（Insulinresistance，IR）有關(guān)，胰島素濃度升高，導(dǎo)致外周脂肪組織發(fā)生分解，使得肝臟從血液中攝取的游離脂肪酸增多。同時游離脂肪酸氧化會隨著胰島素濃度升高而減弱，造成肝臟內(nèi)大量游離脂肪酸轉(zhuǎn)化為三酰甘油，形成單純性非酒精性脂肪肝。“二次打擊”是指“一次打擊”之后，蓄積在肝臟的大量脂質(zhì)發(fā)生氧化應(yīng)激（Oxidation stress，OS）與脂質(zhì)過氧化（Lipid peroxidation，LPO）引起肝細(xì)胞炎癥、肝纖維化、肝硬化、甚至肝細(xì)胞癌[3]。目前臨床上治療NAFLD，主要有降脂藥如非諾貝特類、洛伐他汀類；降糖藥如雙胍類、胰高血糖素樣肽（Glucagon-like peptide-1，GLP-1）受體激動劑和二肽酰肽酶4（Dipeptidyl peptidase-4，DPP-4）抑制劑；抗氧化劑如維生素E（Vitamin E，VE）、還原性谷胱甘肽（Glutathione，GSH）、水飛薊素等；肝保護(hù)藥物如熊去氧膽酸（Ursodeoxycholic acid，UDCA）；FXR 激動劑如奧貝膽酸等。目前，尚無明確藥物治療NAFLD。因此，尋求防治NAFLD 藥物并探討其作用機(jī)制迫在眉睫。

杜仲為杜仲科植物杜仲（Eucommia ulmoidesOliv）的干燥樹皮，是我國傳統(tǒng)藥材，在我國有兩千多年的藥用歷史。《神農(nóng)百草經(jīng)》將其列為上品，性溫，味甘，歸肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，安胎的功效，用于治療肝腎不足，腰膝酸痛，筋骨無力，頭暈?zāi)垦＃焉锫┭硬话驳龋粡V泛用于中藥臨床復(fù)方和多種中成藥中如杜仲降壓片和強(qiáng)力天麻杜仲膠囊。由于杜仲傳統(tǒng)藥用部位為皮部，樹齡達(dá)到一定年限方可剝皮，且剝皮后極易造成杜仲樹死亡，對杜仲資源造成極大浪費(fèi)，嚴(yán)重影響杜仲資源的可持續(xù)發(fā)展。為解決這種問題，人們相繼開展了對杜仲其它非傳統(tǒng)藥用部位化學(xué)成分和藥效研究，其中杜仲葉、雄花、種子等部位的研究較為顯著[4]。在2005年《中國藥典》將杜仲葉單獨(dú)收載為一種藥材，隨后的2版藥典一直沿用[5]。杜仲葉成分豐富，主要含有黃酮類、木脂素類、環(huán)烯醚萜類、多酚類、萜類和甾體類、苯丙素類、多糖類等成分[6]，具有抗氧化、降血壓、調(diào)節(jié)血脂、降血糖、抗骨質(zhì)疏松、抗疲勞、預(yù)防肥胖、抑菌等藥理作用[7]。臨床上主要用于治療高血壓、高血脂、高血糖、安胎及骨質(zhì)疏松等[8,9]。有相關(guān)報道顯示[10,11]，杜仲葉提取物能顯著降低高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠血漿中高血糖和高血脂水平，改善肝臟脂肪變性，對防治NAFLD 有明顯作用。然而，目前杜仲葉提取物防治NAFLD的活性成分及其作用機(jī)制尚不清楚。因此研究杜仲葉提取物防治NAFLD的主要活性成分及其作用機(jī)制意義重大。

2 材料和方法

2.1 材料儀器

HepG2 細(xì)胞系獲自中國科學(xué)院細(xì)胞庫（中國上海）儲存于-80℃冰箱，南美胎牛血清（Gibco），青鏈霉素雙抗（Solarbio），DMEM培養(yǎng)基（Gibco，Lot：8119288），胰蛋白酶（Gibco），TG試劑盒（批號：20190716）、TC試劑盒（批號：20190511）、HDL-C試劑盒（批號：20190713）、LDL-C 試劑盒（批號：20190712）、ALT 試劑盒（批號：2090715），AST試劑盒（批號：20190716）購于南京建成科技有限公司，棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)品（批號：SLBQ8869V），綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（批號：Y24J7K16726）、杜仲苷標(biāo)準(zhǔn)品（批號：K02N7B23963）、車葉草苷標(biāo)準(zhǔn)品（批號：ZN1110BB14）、京尼平苷酸標(biāo)準(zhǔn)品（批號：Y02A9H57757）購于上海源葉科技有限公司，UPLC（美國waters 公司），Discovery V20倒置熒光顯微鏡（德國Zeiss公司），Synergy HT型酶標(biāo)儀（Bio-Tek，USA）。

2.2 杜仲葉提取、分離、純化、凍干

將杜仲葉粉碎，采用60%乙醇在80℃蒸餾提取，第1 次提取3 h，第2 次提取2 h，提取后，合并提取液，紗布過濾，濾液經(jīng)NKA-2 樹脂柱洗脫純化，純化后濾液在60℃下減壓蒸餾濃縮，回收乙醇，得到杜仲葉提取物濃縮液，杜仲葉提取物濃縮液進(jìn)行冷凍干燥制成杜仲葉提取物凍干粉，杜仲葉提取物凍干粉置干燥器中保存。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將HepG2 細(xì)胞在補(bǔ)充有10%胎牛血清，1%青霉素/鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時，采用0.25%胰蛋白酶消化，按1:3進(jìn)行傳代。

2.4 實驗分組及給藥

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞細(xì)胞密度為2 ×105Cells·mL-1，接種于6 孔板。設(shè)正常組、模型組、綠原酸組、杜仲苷組、京尼平苷酸組、車葉草苷組。綠原酸組給藥40μmol·L-1、杜仲苷給藥40μmol·L-1、京尼平苷酸組給藥40μmol·L-1、車葉草苷組給藥40μmol·L-1。

2.5 NAFLD細(xì)胞模型的建立

根據(jù)前期試驗選擇最佳棕櫚酸干預(yù)濃度為300μmol·L-1模擬高脂環(huán)境，建立NAFLD 細(xì)胞模型，干預(yù)HepG2細(xì)胞24 h。

2.6 油紅O染色

將HepG2細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105Cells·mL-1，接種于24 孔板。設(shè)正常組、模型組、綠原酸組、杜仲苷組、京尼平苷酸組、車葉草苷組，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞完全貼壁后，用棕櫚酸處理HepG2細(xì)胞24 h，建立NAFLD細(xì)胞模型。綠原酸、杜仲苷、京尼平苷酸、車葉草苷給藥48 h 后，棄培養(yǎng)基，PBS 沖洗2 次，4%多聚甲醛1 mL 固定細(xì)胞30 min，棄4%多聚甲醛，PBS 清洗2 遍，加入500μL 油紅O 工作液（三蒸水∶油紅O = 2∶3）37℃避光30 min，50%異丙醇洗滌15 s，雙蒸水清洗3 次，至背景透明，倒置顯微鏡拍照，采用Image軟件分析圖像。

2.7 細(xì)胞中TG、TC、LDL-C、HDL-C的檢測

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105Cells·mL-1，接種于6 孔板，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜，待細(xì)胞生長至70%-80%。設(shè)正常組、模型組、綠原酸組、杜仲苷組、京尼平苷酸組、車葉草苷組每組設(shè)置5個復(fù)孔，用棕櫚酸處理HepG2細(xì)胞24 h，建立NAFLD細(xì)胞模型。綠原酸、杜仲苷、京尼平苷酸、車葉草苷給藥48 h 后收集細(xì)胞，細(xì)胞超聲破碎儀超聲裂解，按照TG、TC、HDL-C、LDL-C試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

2.8 細(xì)胞上清液中AST、ALT檢測

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105Cells·mL-1，接種于6孔板，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜，待細(xì)胞生長至70%-80%。設(shè)正常組、模型組、綠原酸組、杜仲苷組、京尼平苷酸組、車葉草苷組每組設(shè)置5個復(fù)孔，用棕櫚酸處理HepG2細(xì)胞24 h，建立NAFLD細(xì)胞模型。綠原酸、杜仲苷、京尼平苷酸、車葉草苷給藥48 h 后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，按照AST、ALT 試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5 軟件進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計分析，兩組之間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），所有數(shù)據(jù)以±s表示。P＜0.05 視為有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 杜仲葉提取物主成分分析

精密稱取杜仲苷標(biāo)準(zhǔn)品7.1 mg，京尼平苷酸標(biāo)準(zhǔn)品8 mg，綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品5.1 mg，車葉草苷標(biāo)準(zhǔn)品6.35 mg，溶于甲醇中，甲醇定容至5 mL，備用。精密稱取69.23 mg 杜仲葉提取物凍干粉溶于80%甲醇，定容至10 mL 備用，精密吸取杜仲葉提取物溶液200μL 并加入甲醇 800 μL，渦旋混勻3 分鐘，13000 rpm 離心15 min 備用。用UPLC-MS 檢測，流動相：A-乙腈，B-0.1%甲酸；色譜柱：Waters MassLynx 100×2.1 mm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：40℃；檢測波長：198 nm（綠原酸、杜仲苷、京尼平苷酸），237 nm（車葉草苷）；進(jìn)樣量：10 μL，混合對照品UPLC 圖譜和杜仲葉提取物UPLC 圖譜（圖1），杜仲葉提取物中杜仲苷含量16.72μg·mg-1、京尼平苷酸含量18.37 μg·mg-1、綠原酸含量6.3μg·mg-1、車葉草苷含量0.14μg·mg-1（表1）。

圖1 高效液相色譜圖

表1 杜仲葉提取物四種化學(xué)成分含量表

3.2 杜仲葉提取物四種主成分對HepG2 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的影響

綠原酸、杜仲苷、京尼平苷酸、車葉草苷（40μmol·L-1）處理HepG2 細(xì)胞48 h，油紅O 染色檢測綠原酸、杜仲苷、京尼平苷酸、車葉草苷對HepG2 細(xì)胞內(nèi)中性脂肪含量的影響，于光學(xué)顯微鏡下觀察（圖2）。顯微鏡下觀察可見，肝細(xì)胞沉積的中性脂肪呈紅色，模型組可見細(xì)胞內(nèi)中性脂肪沉積較多，分布較大。綠原酸組、杜仲苷組、京尼平苷酸組、車葉草苷組與模型組比較，肝細(xì)胞內(nèi)中性脂肪沉積不同程度減少、分布范圍縮小，其中京尼平苷酸效果較明顯。油紅O 染色結(jié)果說明，杜仲葉提取物中綠原酸、杜仲苷、京尼平苷酸、車葉草苷可明顯減少HepG2 細(xì)胞中中性脂肪的形成，其中京尼平苷酸的效果較好。

3.3 杜仲葉提取物四種主成分對HepG2 細(xì)胞內(nèi)TG、TC、LDL-C、HDL-C含量的影響

圖2 HepG2細(xì)胞油紅O染色（200×）

圖3 杜仲葉提取物4種主成分對HepG2細(xì)胞內(nèi)TG、TC、HDL-C、LDL-C的影響

使用TG、TC、LDL-C、HDL-C 試劑盒檢測綠原酸、杜仲苷、京尼平苷酸、車葉草苷給藥48 h，HepG2 細(xì)胞內(nèi)TG、TC、LDL-C、HDL-C 的含量（圖3）。模型組TG含量顯著高于正常對照組（P＜0.001）；模型組TC含量顯著高于正常對照組（P＜0.001）；模型組LDL-C 含量顯著高于空白組（P＜0.001）；模型組HDL-C 含量與正常對照組比較無顯著性變化。與模型組比較，綠原酸顯著減少TG含量（P＜0.01）、杜仲苷顯著減少TG含量（P＜0.01）、京尼平苷酸顯著減少TG含量（P＜0.001）、車葉草苷對細(xì)胞中TG 無顯著影響，其中京尼平苷酸效果最明顯；與模型組比較，綠原酸顯著減少TC 含量（P＜0.01）、杜仲苷顯著減少TC 含量（P＜0.05）、京尼平苷酸顯著減少TC含量（P＜0.001）、車葉草苷顯著減少TC含量（P＜0.05），其中京尼平苷酸效果最明顯；與模型組比較，綠原酸顯著減少LDL-C 含量（P＜0.01）、杜仲苷顯著減少LDL-C 含量（P＜0.01）、京尼平苷酸顯著減少LDL-C 含量（P＜0.001）、車葉草苷顯著減少LDL-C 含量（P＜0.01），其中京尼平苷酸效果最明顯；與模型組比較，綠原酸、杜仲苷、京尼平苷酸、車葉草苷對細(xì)胞中HDL-C含量無顯著改變。總之，京尼平苷酸降低細(xì)胞內(nèi)TG、TC、LDL-C 效果最好。在NAFLD發(fā)生和發(fā)展中，蓄積在肝臟中的脂質(zhì)可發(fā)生氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化，引起肝細(xì)胞炎癥，肝纖維化、肝硬化甚至肝細(xì)胞癌，加重了NAFLD 的發(fā)展。TG、TC、LDL-C進(jìn)入血液中可進(jìn)一步形成高脂血癥，可引發(fā)其它代謝綜合征。實驗結(jié)果說明，杜仲葉提取物中綠原酸、杜仲苷、京尼平苷酸、車葉草苷可明顯減少HepG2 細(xì)胞內(nèi)TG、TC、LDL-C 的含量，能提高肝臟細(xì)胞抗NAFLD活性，其中京尼平苷酸的效果較好。

圖4 杜仲葉提取物四種化合物對HepG2細(xì)胞培養(yǎng)基中AST、ALT的影響

3.4 杜仲葉提取物四種主要成分對HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)液中AST、ALT的影響

使用AST、ALT 試劑盒檢測綠原酸、杜仲苷、京尼平苷酸、車葉草苷給藥48 h，HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)液中AST、ALT 的含量（圖4）。實驗結(jié)果顯示，模型組與正常組比較，細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT 顯著升高（P＜0.01）、ALT 顯著上升（P＜0.001）。與模型組比較，綠原酸可顯著減少ALT 含量（P＜0.001）、杜仲苷可減少ALT 含量（P＜0.01）、京尼平苷酸可顯著減少ALT 含量（P＜0.001）、車葉草苷可顯著減少ALT 含量（P＜0.01），其中綠原酸和京尼平苷酸效果較好。綠原酸、杜仲苷、京尼平苷酸可降低細(xì)胞培養(yǎng)液中AST 含量，其中京尼平苷酸效果最好，車葉草苷對細(xì)胞培養(yǎng)液中AST 無影響。與模型組比較，綠原酸可顯著減少AST 含量（P＜0.001）、杜仲苷可顯著減少AST 含量（P＜0.001）、京尼平苷酸可顯著減少AST 含量（P＜0.001），車葉草苷對AST 含量無顯著影響，其中京尼平苷酸效果最好。總之，京尼平苷酸降低細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT、AST 效果最好。對于NAFLD 患者AST、ALT 能較好地判斷脂肪變性程度以及炎癥程度，可用于評估NAFLD 患者預(yù)后。實驗結(jié)果說明，杜仲葉提取物中綠原酸、杜仲苷、京尼平苷酸、車葉草苷可明顯減少HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT、AST 含量，能改善NAFLD 模型肝臟脂肪變性和炎癥，其中京尼平苷酸效果最好。

4 討論

1980年Ludwig 等[12]將無飲酒史肥胖和糖尿病（DM）患者出現(xiàn)的非酒精性脂肪肝和肝小葉炎癥病變命名為非酒精性脂肪肝炎（Non-alcoholic steatohepatitis，NASH），才步入NAFLD 研究時代。隨著生活方式轉(zhuǎn)變，其患病率逐漸上升，西方國家的患病率約為15%-30%，我國約15%，且發(fā)病率呈逐年上升和低齡化趨勢[13]。NAFLD 主要特征是三酰甘油在肝臟大量蓄積，在不存在肝細(xì)胞損傷情況下，被稱為單純性脂肪肝，一般認(rèn)為是良性的。在存在肝小葉炎癥和肝細(xì)胞損傷情況下，被稱為非酒精性脂肪肝炎。NAFLD 患者易患肝臟相關(guān)并發(fā)癥，如肝纖維化、肝硬化、肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）和肝外疾病如心血管疾病（Cardiovascular disease，CVD）和糖尿病[14]。目前，尚沒有治療NAFLD 有效藥物，因此開發(fā)治療NAFLD的藥物并探討其作用機(jī)制非常有意義。

杜仲是我國特有的藥材，其藥用歷史悠久，在臨床上有著廣泛的應(yīng)用。杜仲葉活性成分豐富、藥理作用突出、再生循環(huán)能力強(qiáng)、產(chǎn)量巨大，是很好的杜仲樹皮替代來源。關(guān)于杜仲葉對杜仲樹皮的替代性研究是目前的一個熱點(diǎn)。許多研究結(jié)果表明，杜仲葉和杜仲樹皮相比，活性成分基本相同，藥理作用相似。近年來有研究表明[15]，杜仲葉總黃酮能顯著降低高血脂大鼠血清中TC、TG、脂蛋白、載脂蛋白B（Apolipoprotein B，Apo-B）及LDL-C 含量，顯著升高HDL-C 及載脂蛋白A（Apolipoprotein A，Apo-A）的含量。有研究表明[16]，杜仲葉多糖能明顯降低高血脂模型小鼠血清TC、TG、LDL-C、脂蛋白a 和Apo-B 水平，明顯提高HDL-C 和Apo-A 水平。并且有體外研究表明[17]，杜仲葉提取物能通過增強(qiáng)溶酶體活性來降低棕櫚酸誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和肝臟脂質(zhì)積累。其機(jī)制可能是杜仲葉提取物降低肝臟脂肪酸合酶（Fatty acid synthase，F(xiàn)AS）和3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA，HMG-CoA）還原酶及肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶（Carnitine Palmitoyltransferase 1A，CPT-1A）活性，通過抑制肝臟脂肪酸和膽固醇的生物合成，增加肝臟脂肪酸β氧化，減少肝臟脂質(zhì)積累。有研究表明[18]，NAFLD 患者血清中ALT 升高最常見，常伴有AST 升高。該研究通過制備杜仲葉提取物，檢測杜仲葉提取物中主要成分，對杜仲葉提取物主要成分進(jìn)行抗NAFLD研究。實驗結(jié)果顯示，杜仲葉所含主要成分為綠原酸、杜仲苷、京尼平苷酸和車葉草苷，其中京尼平苷酸的含量較高。油紅O 染色結(jié)果顯示，杜仲葉四種主要成分能不同程度降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量，京尼平苷酸的效果最好。綠原酸、杜仲苷、京尼平苷酸和車葉草苷能不同程度降低細(xì)胞內(nèi)TG、TC、LDL-C 的含量，其中京尼平苷酸效果最好；綠原酸、杜仲苷、京尼平苷酸能明顯降低細(xì)胞上清液ALT、AST含量，其中京尼平苷酸效果最好。研究結(jié)果表明，杜仲葉所含四種主要成分可不同程度改善細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量，其中京尼平苷酸效果最好，可作為杜仲葉中潛在的抗非酒精性脂肪肝活性成分，其作用機(jī)制需進(jìn)一步研究，且該研究對促進(jìn)我國杜仲資源可持續(xù)發(fā)展具有重要意義，值得進(jìn)一步研究。