HER2陽性胃癌組織MSI和PD-L1表達及意義

[摘要]目的驗證二代測序（NGS）與免疫組織化學（IHC）技術在胃癌人表皮生長因子受體2（HER2）狀態評估中的一致性，分析HER2陽性胃癌微衛星不穩定性（MSI）、程序性死亡配體1（PD-L1）表達與臨床病理特征的關系。方法收集行胃癌手術且術后組織標本IHC檢測HER2（3+）病人92例。采用NGS技術檢測病人癌組織中HER2基因擴增情況及MSI狀態;采用PD-L1 IHC 22C3 pharmDx試劑盒檢測癌組織中PD-L1的表達情況，結果分別以陽性組合評分（CPS）和腫瘤比例評分（TPS）進行計算。結果IHC檢測HER2陽性的胃癌病人92例，NGS檢測84例存在HER2基因擴增，IHC與NGS檢測結果的一致率為91.3%。92例HER2陽性胃癌病人中，微衛星穩定（MSS）病人90例（97.8%），微衛星高度不穩定（MSI-H）病人2例（2.2%）;84例存在HER2基因擴增的病人均呈MSS狀態，無MSI-H病人。按CPS標準，92例HER2陽性病人PD-L1陽性率為89%，PD-L1表達與臨床病理特征之間無相關性。按TPS標準，92例HER2陽性病人PD-L1陽性率為24%，PD-L1表達與臨床病理特征之間無相關性。結論IHC和NGS技術檢測胃癌組織HER2表達的一致率較高。胃癌組織中HER2基因擴增與MSI-H可能存在互斥關系。HER2陽性胃癌CPS標準下的PD-L1陽性率高于TPS標準下的PD-L1陽性率，但二者均與臨床病理特征無關。

[關鍵詞]胃腫瘤;人表皮生長因子受體2;B7-H1抗原;微衛星不穩定性;高通量核苷酸序列分析;免疫組織化學

[中圖分類號]R735.2[文獻標志碼]A[文章編號]2096-5532（2021）01-0059-05

[ABSTRACT]ObjectiveTo verify the consistency of next-generation sequencing （NGS） and immunohistochemistry （IHC） in assessing the status of human epidermal growth factor receptor 2 （HER2） in gastric cancer， and to investigate the association of microsatellite instability （MSI） and programmed death ligand 1 （PD-L1） expression with clinicopathological characteristics of HER2-positive gastric cancer. MethodsA total of 92 patients who underwent gastric cancer surgery and whose postoperative tissue specimen was HER2（3+） based on IHC were enrolled. NGS technique was used to detect HER2 gene amplification and MSI status in cancer tissue; PD-L1 IHC 22C3 pharmDx kit was used to measure the expression of PD-L1 in cancer tissue; the results were calculated by combined positive score （CPS） and tumor proportion score （TPS）. ResultsIn this study， there were 92 gastric cancer patients with positive HER2. NGS detection showed that 84 patients had HER2 gene amplification， and the consistency rate between IHC and NGS detection was 91.3%. Among the 92 patients with HER2-positive gastric cancer， 90 （97.8%） had microsatellite stable （MSS） tumors and 2 （2.2%） had microsatellite instability-high （MSI-H） tumors; and 84 patients with HER2 gene amplification had MSS tumors， while no patient had MSI-H tumors. According to the CPS criteria， 92 HER2-positive patients had a positive rate of PD-L1 of 89%， and there was no association between PD-L1 expression and clinicopathological characteristics. According to the TPS criteria， 92 HER2-positive patients had a positive rate of PD-L1 of 24%， and there was no association between PD-L1 expression and clinicopathological characteristics. ConclusionIHC and NGS have a high consistency rate in detecting the expression of HER2 in gastric tissue. There may be a mutually exclusive relationship between HER2 gene amplification and MSI-H in gastric cancer tissue. The positive rate of PD-L1 in HER2-positive gastric cancer under the CPS criteria is higher than that under the TPS criteria， but they are not associated with clinicopathological characteristics.

[KEY WORDS]stomach neoplasms; human epidermal growth factor receptor 2; B7-H1 antigen; microsatellite instability; high-throughput nucleotide sequencing; immunohistochemistry

人表皮生長因子受體2（HER2）陽性的轉移性/不可切除胃癌病人預后差，曲妥珠單抗聯合化療是目前標準治療模式，但該聯合方案的生存獲益有限。免疫治療被認為是腫瘤治療中最具前景的治療方法，然而其在胃癌中的應用仍不理想，且缺乏篩選有效人群的理想生物標記物。微衛星不穩定性（MSI）及程序性死亡配體1（PD-L1）的表達水平在多種腫瘤中顯示出與免疫治療效果密切相關，但目前關于胃癌病人HER2狀態、MSI狀態及PD-L1表達情況相關性研究報道較少。本研究旨在驗證二代測序（NGS）與免疫組織化學（IHC）技術在胃癌HER2狀態評估中的一致性，分析HER2陽性胃癌組織中MSI狀態、PD-L1表達與臨床病理特征的關系。

1資料與方法

1.1一般資料

使用關鍵詞“胃癌”、“大標本”、“HER2”在青島大學附屬醫院病理資料數據庫中搜索2013年1月—2017年12月行胃癌手術的病人，共搜索到病人1 390例。所有病人術后大標本均已進行HER2的IHC檢測，其中105例病人的組織標本為HER2（3+），即HER2陽性，選取92例術前未行放化療的HER2陽性胃癌病人納入本研究。入組的92例病人中，男性75例，女性17例;年齡35～87歲，中位年齡64歲;AJCC第8版分期Ⅰ期11例，Ⅱ期32例，Ⅲ期41例，Ⅳ期8例;Lauren分型腸型58例，彌漫型12例，混合型21例;腺癌82例，黏液腺癌5例，印戒細胞癌5例;高分化2例，中分化39例，低分化51例。

1.2NGS檢測HER2基因有無擴增及MSI狀態

1.2.1組織DNA提取石蠟組織切片行脫蠟、刮片、消化、升溫、離心等處理，收集洗脫液于無菌離心管中，進行NGS檢測。

1.2.2文庫構建先將基因組DNA進行超聲片段化處理，然后進行末端修復、3′端加A、添加接頭以及PCR擴增，得到預文庫。預文庫在探針作用下進行16～24 h的雜交，抓取出檢測所需的目的片段，最后給靶序列加上測序所需的分子標簽，完成文庫構建。

1.2.3基因測序使用IlluminaNextseq 500/550測序儀以快速模式進行大規模平行測序。向反應體系中同時添加DNA聚合酶、接頭引物和帶有堿基特異熒光標記的4種dNTP，再加入激發熒光所需的緩沖液，用激光激發熒光信號，用光學設備完成熒光信號的記錄，最后利用計算機軟件將光學信號轉化為測序堿基。

1.2.4數據分析NGS檢測會產生大量的原始序列數據，將原始序列數據進行初級處理，過濾后得到clean data（刪除質量不好的原始數據后得到的數據，常見的刪除方法有去接頭、去N含量高及質量評分較低的原始數據等）。對clean data進行序列比對并捕捉基因點突變、缺失、插入、拷貝數變化、結構變異等多種變異信息，并注釋。用SPSS 22.0軟件進行結果分析。

1.3IHC檢測PD-L1蛋白表達

應用22C3抗體濃縮物在Dako ASL48自動染色儀中對組織標本進行染色，將染色結果與Dako ASL48平臺上的PD-L1 IHC 22C3 pharmDx試劑盒進行比對以評估PD-L1表達。IHC檢測均設陽性對照和陰性對照。

1.4檢測結果判定

1.4.1HER2基因擴增及MSI狀態①HER2基因擴增：拷貝數/細胞2.75～3.00，且一個基因60%以上的探針捕獲區域（bin）在癌癥樣本中的覆蓋深度顯著高于基線水平，同時整個基因區域的覆蓋水平與基線水平差異具有統計學意義。②MSI狀態：40%以上MSI基因座（loci）長度不穩定，則認為是微衛星高度不穩定（MSI-H）;小于15% MSI loci長度不穩定，則認為是微衛星穩定（MSS）;如果長度不穩定的MSI loci在15%～40%之間，則認為是微衛星低度不穩定（MSI-L）。

1.4.2PD-L1表達陽性①組合陽性評分（CPS）：PD-L1染色細胞（包括腫瘤細胞、淋巴細胞、巨噬細胞）的數量除以活腫瘤細胞總數再乘以100。如果CPS≥1，則認為該病人存在PD-L1過表達，即PD-L1表達陽性。②腫瘤比例評分（TPS）：相對于樣品中存在的所有腫瘤細胞中PD-L1陽性細胞（具有（1+）～（3+）強度的全部或部分細胞膜染色的活腫瘤細胞）的百分比。如果TPS≥1%，則認為該病人存在PD-L1過表達，即PD-L1表達陽性。

1.5統計分析

用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，計數資料比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有顯著性。

2結果

2.1HER2基因擴增情況

本研究IHC檢測HER2（3+）胃癌病人92例，NGS檢測顯示84例病人存在HER2基因擴增，8例病人未顯示HER2基因擴增，IHC與NGS檢測結果的一致性為91.3%。HER2基因擴增病人中合并HER2基因錯義突變者10例（10.7%），合并基因融合者17例（20.7%），同時合并基因錯義突變與基因融合者1例（1.1%）。

2.2MSI狀態與HER2基因擴增的關系

本文研究92例HER2陽性胃癌病人中，MSS病人90例（97.8%），MSI-H病人2例（2.2%），84例發生HER2基因擴增的病人均呈MSS狀態，無MSI-H病人，HER2基因擴增與MSI-H可能存在互斥關系。

2.3CPS標準下HER2陽性胃癌組織中PD-L1表達與臨床病理特征的關系

本研究92例HER2陽性胃癌病人PD-L1陽性率為89%，其中CPS≥5者占81.5%，CPS≥10者占55.0%。在該評分標準下，PD-L1表達與病人的臨床病理特征無相關性（P>0.05）。見表1。

2.4TPS標準下HER2陽性胃癌組織中PD-L1表達與臨床病理特征的關系

本研究92例HER2陽性胃癌病人PD-L1陽性率為24%，無PD-L1表達超過50%的病人。在該評分標準下，PD-L1表達與病人的臨床病理特征無相關性（P>0.05）。見表2。

3討論

目前，HER2受體是胃癌靶向治療最為有效靶點，其過表達主要由HER2基因擴增導致，臨床常用檢測方法為IHC和熒光原位雜交（FISH），陽性標準是HER2 IHC（3+）或IHC（2+）/FISH+。各國家/地區的HER2陽性胃癌發病率存在差異，為7%～34%，兩項針對中國人群的研究結果分別為13%和12%[1-2]。本研究共檢索到青島大學附屬醫院2013年1月—2017年12月行胃癌手術且行HER2 IHC檢測病人1 390例，其中HER2（3+）胃癌病人105例，HER2（2+）胃癌病人53例，陽性率為7.5%。此結果與我國既往報道的研究數據差異較大，考慮主要原因是IHC檢測HER2（2+）者未采用FISH檢測進一步驗證和數據搜索時出現信息偏倚。ROSS等[3]研究表明，在乳癌和胃癌中采用NGS技術確定HER2狀態是可行的，尤其是針對IHC或者FISH評價中模棱兩可的病例具有明顯優勢。JANJIGIAN等[4]研究顯示，對于評估胃癌組織HER2陽性狀態，IHC/FISH和NGS的一致率為93.7%。在本研究中，IHC檢測HER2（3+）病人共92例，NGS檢測84例發生HER2基因擴增，兩者一致率為91.3%，與上述研究結果基本一致，提示NGS檢測可以作為胃癌HER2狀態評估的方法之一。

有研究結果顯示，MSI-H在胃癌中的發生頻率為5.6%～33.3%，但是并無研究報道其在HER2陽性胃癌中的發生頻率[5]。癌癥基因組圖譜（TCGA）數據顯示，MSI-H的胃癌病人占21.7%，該亞型具有高突變率，但是缺乏HER2等常見基因的擴增結果[6]。亞洲癌癥研究小組（ACRG）的研究結果顯示，61例MSI胃癌病人均未見HER2基因擴增，在MSS胃癌病人中HER2基因擴增更常見。本研究中，92例HER2陽性胃癌病人中有MSI-H胃癌病人2例（2.2%），但是發生HER2基因擴增的84例胃癌病人均表現為MSS，未發現MSI-H病人，結合TCGA、ACRG研究結果，我們認為HER2基因擴增與MSI-H之間可能存在互斥關系。當然，這需要進一步分子研究證實。

對于應用于胃癌中計算PD-L1表達量的兩種方法，TPS已被證實不能有效預測病人對免疫藥物的治療反應，而CPS則具有良好的預測作用及可重復性。這兩者的區別在于CPS不只反映腫瘤細胞中PD-L1的表達，同時還反映了免疫細胞中PD-L1的表達。既往研究顯示，胃癌組織中PD-L1過表達與浸潤深度（T分期）、淋巴結轉移（N分期）、血管侵犯、EB病毒感染、MSI狀態等顯著相關，而與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、Lauren分型、TNM分期、淋巴管侵犯、神經浸潤等無明顯關系[7]。而本研究結果顯示，無論在TPS還是在CPS標準下，PD-L1過表達與HER2陽性胃癌病人的性別、年齡、腫瘤部位、術后分期、T分期、N分期、血管浸潤、神經侵犯、分化程度等均無明顯關系。本研究中CPS標準下HER2陽性胃癌病人PD-L1的陽性率為89%，明顯高于以往報道的胃癌組織PD-L1陽性率。根據公式CPS=TPS+MIDS（免疫細胞PD-L1染色陽性的比例）[8]，可以大體估算HER2陽性胃癌組織中免疫細胞PD-L1陽性率約為65%，而THOMPSON等[9]報道胃癌組織中浸潤免疫細胞的PD-L1陽性率為44%，可以看出HER2陽性胃癌組織免疫細胞上有更多的PD-L1表達。有研究表明，HER2受體過表達可促進胃癌細胞上PD-L1的表達;進一步研究發現，抑制HER2信號轉導途徑中PI3K-AKT-mTOR通路可降低發生HER2蛋白過表達的胃癌細胞上PD-L1的表達[10-11]。上述研究在不同方面解釋了本研究中HER2陽性胃癌組織中PD-L1陽性率較高的原因。

KEYNOTE-061Ⅲ期臨床試驗的陰性結果宣告了免疫治療在胃癌二線治療中的失敗，但亞組分析顯示，在PD-L1 CPS≥10的病人中，帕博利珠單抗對比紫杉醇化療觀察到了總生存期（OS）獲益的趨勢（17.4 vs 10.8個月）[12]。本研究中，HER2陽性胃癌病人具有更高的PD-L1陽性率，其中CPS≥10的病人占55.0%，這提示HER2陽性胃癌病人更有可能在免疫治療中獲益。另外，臨床前研究顯示，抗程序性死亡受體1（PD-1）單抗聯合抗HER2治療存在協同作用，曲妥珠單抗可以刺激HER2特異性的T細胞反應，增加腫瘤細胞的PD-L1表達，而抗PD-1單抗可以增強曲妥珠單抗的T細胞特異性免疫[13-14]。2019年ASCO年會報道一項Ⅱ期臨床研究結果顯示，曲妥珠單抗聯合化療、帕博麗珠單抗治療HER2陽性胃癌客觀緩解率（ORR）達到87%，疾病控制率（DCR）高達100%，12個月的總生存率為76%，該研究證實了HER2陽性胃癌靶向治療與免疫治療聯合治療方案的應用價值[15]。

綜上所述，IHC和NGS技術檢測胃癌組織中HER2表達的一致率較高，NGS技術檢測評估胃癌HER2狀態具有潛在價值;胃癌組織中HER2基因擴增與MSI-H可能存在互斥關系;HER2陽性胃癌CPS標準下的PD-L1陽性率高于TPS標準下的PD-L1陽性率，但二者均與臨床病理特征無關。本研究的不足之處是缺乏HER2陰性胃癌病例作為對照，故本研究結果仍需要進一步的研究證實。

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（本文編輯 馬偉平）