MiR-371a-5p表達與非小細胞肺癌預后的關系

[摘要]目的探討微小RNA-371a-5p（miR-371a-5p）在非小細胞肺癌（NSCLC）中的表達及臨床意義。方法采用實時定量聚合酶鏈反應技術（RT-qPCR）檢測136例NSCLC腫瘤組織和其癌旁正常組織（距離腫瘤5 cm以上）標本miR-371a-5p的表達，應用χ2檢驗分析miR-371a-5p表達與病人臨床病理特征之間關系，Kaplan-Meier生存分析模型分析miR-371a-5p表達與NSCLC病人總生存期及無病生存期的相關性。采用單因素和多因素Cox模型分析miR-371a-5p對NSCLC病人預后預測價值。結果與癌旁正常組織相比，NSCLC腫瘤組織miR-371a-5p表達明顯升高（t=12.515，P<0.01）。NSCLC病人miR-371a-5p高表達與腫瘤大?。é?=4.960，Plt;0.05）、TNM分期（χ2=7.061，Plt;0.05）和淋巴結轉移（χ2=10.675，Plt;0.01）顯著相關。Kaplan-Meier生存分析顯示，miR-371a-5p高表達組病人的總生存期低于miR-371a-5p低表達組（χ2=9.051，Plt;0.001）。單因素和多因素Cox分析表明，miR-371a-5p表達可作為NSCLC病人總生存期的獨立預測指標（HR=1.8，95%CI=1.0～3.2，Plt;0.05）。結論MiR-371a-5p在NSCLC腫瘤組織中高表達并可以作為病人的預后生物標志物。

[關鍵詞]癌，非小細胞肺;微RNAs;預后

[中圖分類號]R734.2[文獻標志碼]A[文章編號]2096-5532（2021）01-0069-04

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of microRNA-371a-5p （miR-371a-5p） in non-small cell lung cancer （NSCLC）. MethodsReal-time quantitative PCR was used to measure the expression of miR-371a-5p in 136 NSCLC tissue samples and corresponding adjacent tissue samples （more than 5 cm away from the tumor）. The chi-square test was used to investigate the association between miR-371a-5p expression and clinical features， and the Kaplan-Meier survival analysis was used to analyze the correlation of miR-371a-5p expression with overall survival and disease-free survival of NSCLC patients. Univariate and multivariate Cox analyses were used to determine the value of miR-371a-5p in predicting the prognosis of NSCLC patients. ResultsCompared with the adjacent tissue samples， NSCLC tissue samples had a significant increase in the expression of miR-371a-5p （t=12.515，Plt;0.01）. The high expression of miR-371a-5p in NSCLC patients was significantly asso-ciated with tumor size （χ2=4.960，Plt;0.05）， TNM stage （χ2=7.061，Plt;0.05）， and lymph node metastasis （χ2=10.675，Plt;0.01）. The Kaplan-Meier survival analysis showed that the patients with high expression of miR-371a-5p had significantly lower overall survival than those with low expression of miR-371a-5p （χ2=9.051，Plt;0.01）. The univariate and multivariate Cox analyses showed that the expression of miR-371a-5p （HR=1.8，95%CI=1.0-3.2，Plt;0.05） could be used as an independent predictive factor for the overall survival of patients with NSCLC. ConclusionMiR-371a-5p is highly expressed in NSCLC tissue and can be used as a prognostic biomarker for NSCLC patients.

[KEY WORDS]carcinoma， non-small-cell lung; microRNAs; prognosis

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，每年能導致160萬人以上死亡[1]。肺癌主要分為兩大類：小細胞肺癌（SCLC）和非小細胞肺癌（NSCLC）[2]。其中，NSCLC占所有肺癌類型的80%以上[3]。對于早期肺癌臨床治療主要以手術為主，中晚期肺癌臨床治療主要以化療或者化療聯合局部放射治療為主，以控制腫瘤進展[4]。肺癌臨床診斷較晚是其預后不良的主要原因[5-7]。與肺癌轉移相關的生物標志物的研究對肺癌病人的預后監測具有重要意義。MicroRNA是由22～25個核苷酸組成的非編碼RNA。目前，越來越多的研究結果表明，microRNA在腫瘤的發生和發展過程中起著重要的作用[8-10]。MiR-371a-5p作為一種重要的miRNA，在胰腺癌、子宮絨毛膜癌以及肝癌的發生、發展中發揮重要作用[11-13]。然而，miR-371a-5p在NSCLC中的作用尚不清楚。本文探討miR-371a-5p表達在NSCLC病人中的預后價值?，F將結果報告如下。

1資料和方法

1.1標本及其來源

從2014—2018年在我院行胸腔鏡根治性或姑息性切除術的NSCLC病人中，選取136例NSCLC腫瘤組織和癌旁正常組織（距離腫瘤5 cm以上）標本。病人術前均未接受放療或化療等輔助治療，無其他重大基礎疾?。ㄈ缣悄虿　⒐谛牟〉龋⑶医浶g后組織病理學檢查、根據國際癌癥聯合會（UICC）第8版的術后病理分期標準確診為NSCLC。病人的腫瘤組織及正常組織使用RNA保護液固定并保存于-80 ℃冰箱中。從醫院病歷系統中檢索病人的臨床資料。以診斷之日起至最后一次隨訪或與癌癥相關的死亡時間計為病人的總生存期;以診斷之日至腫瘤復發時間計為病人的無病生存期。所有病人的最終隨訪時間均為2019年10月。

1.2實時定量熒光PCR（RT-qPCR）法檢測miR-371a-5p表達

于-80 ℃冰箱中取出預先保存的腫瘤組織標本和正常組織標本，應用TRIzol試劑提取總RNA，核酸蛋白定量儀測定吸光度（A）值，A260/A280值為1.8～2.0表明樣本純度符合要求。使用First-Strand cDNA Synthesis試劑盒將總RNA反轉錄為互補DNA（cDNA）。反應條件為：42 ℃、2 min，37 ℃、15 min， 85 ℃、5 s。取cDNA 2 μL和SYBR Green PCR Master Mix 18 μL用于RT-qPCR。反應條件為：預變性 95 ℃、2 min;然后 95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，72 ℃、5 min，共進行40個循環。以U6作為內參基因。應用2-ΔΔCt法計算miR-371a-5p的相對表達水平。 MiR-371a-5p以及U6引物購于上海市吉瑪基因生物科技有限公司，RNA反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。RT-qPCR引物及其序列見表1。

1.3統計學方法

應用SPSS 23.0軟件進行統計分析。計量資料結果以±s表示，數據間比較采用t檢驗;計數資料比較采用卡方檢驗;使用對數秩檢驗對Kaplan-Meier生存曲線進行統計學檢驗;使用單因素和多因素Cox比例風險模型分析影響病人預后的危險因素。以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1NSCLC腫瘤組織和癌旁正常組織miR-371a-5p 表達比較

NSCLC腫瘤組織miR-371a-5p表達為1.82±0.67，正常組織為0.76±0.38，兩組比較差異有顯著性（t=12.515，P<0.01）。

2.2MiR-371a-5p表達與NSCLC病人臨床病理特征的關系

根據NSCLC腫瘤組織中miR-371a-5p表達的中位數，將136例病人分為高表達組（2-ΔΔCt值≥0.903 3）和低表達組（2-ΔΔCt值<0.903 3）。NSCLC組織miR-371a-5p高表達與腫瘤大小（χ2=4.960，Plt;0.05）、TNM分期（χ2=7.061，Plt;0.05）和淋巴結轉移（χ2=10.675，Plt;0.01）等相關。見表2。

2.3MiR-371a-5p表達與NSCLC病人預后相關性

MiR-371a-5p高表達組NSCLC病人的中位總生存期為2.33年（95%CI=0.41～4.44），中位無病生存期為1.59年（95%CI=0.32～4.32）;miR-371a-5p低表達組病人的中位總生存期為2.78年（95%CI=0.22～4.79），中位無病生存期為2.27年（95%CI=0.21～4.78）。Kaplan-Meier生存分析顯示， miR-371a-5p高表達組NSCLC病人的總生存期顯著高于低表達組（χ2=9.051，Plt;0.003），但是兩組之間無病生存期比較差異無顯著性（χ2=0.821，Pgt;0.05）。見圖1。單因素Cox分析顯示，淋巴結轉移（HR=4.5，95%CI=2.4～8.5，P<0.01）、遠處轉移（HR=2.2，95%CI=1.0～4.6，Plt;0.05）、TNM分期（HR=2.2，95%CI=1.2～3.8，Plt;0.01）和miR-371a-5p表達（HR=2.3，95%CI=1.3～3.9，Plt;0.01）與NSCLC病人的總生存期顯著相關。見表3。以單因素Cox分析中有統計學意義的變量作為自變量進行多因素Cox分析，結果顯示，淋巴結轉移（HR=4.0，95%CI=2.1～7.7，P<0.01）和miR-371a-5p表達（HR=1.8，95%CI=1.0～3.2，Plt;0.05）是NSCLC病人總生存期的獨立預測指標。見表4。

3討論

在美國，癌癥5年總體存活率在60%左右，但肺癌的5年存活率只有18%[14]。大多數的肺癌在初次診斷時即為局部晚期甚至存在遠處轉移，這也是肺癌總體預后不良的重要原因之一[15]。尋找新的治療標靶或新的生物標志物，對于提高肺癌病人的生存率以及改善預后具有非常重要的意義。

MiR-371a-5p作為一種重要的miRNA與多種癌癥密切相關。MiR-371a-5p在胰腺癌組織通過與TUSC7結合抑制其抑癌作用從而導致胰腺癌的發生、發展[11]。有研究表明，miR-371a-5p可直接靶向BCCIP的3′-UTR區并參與調節子宮絨毛膜癌組織中與腫瘤轉移相關的多條途徑，進一步激活了絨毛膜癌轉移的下游通路，導致絨毛膜癌細胞轉移的發生[12]。MiR-371a-5p表達上調在乙型肝炎相關肝癌中起重要作用，其表達與HBV和睪丸激素呈正相關。HBV和睪丸激素可通過LEF-1/miR-371a-5p/SRCIN1/PTN/Slug途徑，促進肝癌細胞的增殖和轉移[13]。這些研究結果表明，miR-371a-5p在多種癌癥的發生、發展和轉移中起重要作用，但miR-371a-5p在NSCLC中的作用仍不清楚。

本文RT-qPCR檢測結果顯示，與癌旁正常組織相比，NSCLC腫瘤組織中miR-371a-5p的表達明顯上調;miR-371a-5p表達與NSCLC的腫瘤大小、TNM分期和淋巴結轉移密切相關，提示miR-371a-5p可以用作預后監測的潛在生物標志物。本文單因素和多因素Cox分析結果顯示，miR-371a-5p表達是NSCLC病人總生存期的獨立預測指標。此外，Kaplan-Meier分析顯示，miR-371a-5p高表達病人總體生存率較低，提示miR-371a-5p在NSCLC中可能發揮著癌基因的作用。由于本文研究樣本數量有限，且為單中心研究，無法充分控制混雜因素的影響，因此miR-371a-5p在NSCLC發展和轉移中的分子機制仍有待進一步研究。

綜上所述，miR-371a-5p在NSCLC腫瘤組織中表達上調并與病人不良預后相關，miR-371a-5p可以作為一種潛在的監測NSCLC病人預后的生物標志物。

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（本文編輯 黃建鄉）