α-synuclein對多巴胺能神經元凋亡和氧化損傷影響

[摘要]目的探討α-共核蛋白（α-synuclein）對多巴胺能神經元凋亡、氧化損傷和炎癥的調節作用。方法用H2O2誘導MES23.5細胞的氧化損傷，并在MES23.5細胞中過表達α-synuclein。用谷胱甘肽（GSH）來抵抗MES23.5細胞氧化損傷。采用流式細胞術檢測細胞凋亡，分別采用相關試劑盒檢測活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）、白細胞介素（IL）-6、IL-1β和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的水平，以Western blot法檢測細胞中B淋巴細胞瘤-2基因蛋白（Bcl-2）和Bcl-2相關x蛋白（Bax）表達。結果過表達α-synuclein可提高MES23.5細胞凋亡率和ROS、IL-6、IL-1β及TNF-α水平，抑制細胞中的SOD活力（F=188.54～315.52，P<0.05）。H2O2可誘導α-synuclein過表達的MES23.5細胞中α-synuclein的表達、細胞凋亡率和ROS活力增加（F=196.49～251.74，P<0.05）。GSH處理α-synuclein過表達的MES23.5細胞后，α-synuclein表達降低，凋亡率和ROS活力降低（F=149.25～258.96，P<0.05）。結論氧化損傷能夠增強α-synuclein促進的細胞凋亡和炎癥反應，從而放大多巴胺能神經元的氧化損傷。

[關鍵詞]α-共核蛋白;多巴胺能神經元;氧化還原酶類;細胞凋亡;帕金森病

[中圖分類號]R322.8;R345.4[文獻標志碼]A[文章編號]2096-5532（2021）01-0095-05

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the regulatory effects of α-synuclein on the apoptosis， oxidative damage， and inflammation of dopaminergic neurons. MethodsWe overexpressed α-synuclein in MES23.5 cells， and used H2O2 to induce oxidative damage and glutathione （GSH） to resist oxidative damage in MES23.5 cells. Flow cytometry was used to detect cell apoptosis. Test kits were applied to measure the levels of reactive oxygen species （ROS）， superoxide dismutase （SOD）， interleukin （IL）-6， IL-1β， and tumor necrosis factor-α （TNF-α）. Western blot was used to determine the expression of B-cell lymphoma-2 protein and B-cell lymphoma-2-associated x protein. Resultsα-Synuclein overexpression increased the apoptosis rate， upregulated the levels of ROS， IL-6， IL-1β， and TNF-α， and inhibited the activity of SOD in MES23.5 cells （F=188.54-315.52，Plt;0.05）. H2O2 increased α-synuclein expression， the apoptosis rate， and the activity of ROS in α-synuclein-overexpressed MES23.5 cells （F=196.49-251.74，Plt;0.05）. GSH decreased the expression of α-synuclein， the apoptosis rate， and the activity of ROS in α-synuclein-overexpressed MES23.5 cells （F=149.25-258.96，Plt;0.05）. ConclusionOxidative damage can enhance α-synuclein-mediated apoptosis and inflammatory response， which further amplifies the oxidative injury of dopaminergic neurons.

[KEY WORDS]α-synuclein; dopaminergic neurons; oxidoreductases; apoptosis; Parkinson disease

帕金森病（PD）病人多見黑質中多巴胺能神經元的選擇性丟失[1-2]，但不清楚此過程的發病機制。已發現Alzheimer病（AD）病人體內氧化應激反應過度增強以及神經炎癥和凋亡級聯反應的激活[3]，且在PD的多巴胺能神經元變性中起關鍵作用[3-5]。α-共核蛋白（α-synuclein）異常積聚所參與引起的神經系統變性疾病統稱為共核蛋白病，包括PD和AD等，表明α-synuclein可能在PD等神經退行性疾病中起作用[6]。聚集體的α-synuclein蛋白是PD的病理學標志物[7]，且在PD病人運動障礙發生前能夠檢測出α-synuclein表達[8]。已有研究結果顯示，抑制α-synuclein的表達有助于改善砷誘導的多巴胺細胞PC12的凋亡[9]，表明α-synuclein有潛力成為PD診療的關鍵靶點之一[10]。然而，α-synuclein對多巴胺能神經元氧化應激的影響仍不明確。因此，本文通過在體外多巴胺能神經元細胞中過表達α-synuclein，研究α-synuclein對細胞損傷、炎癥、氧化應激的作用，旨在為PD病人認知障礙的治療提供新靶點和新思路。

1材料與方法

1.1實驗材料

多巴胺能神經元細胞MES23.5（MZ-1693，明舟生物，寧波）;胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，美國）;DMEM/F12培養基（Sigma-Aldrich）和2’，7’-二氯熒光素二乙酸酯（DCFDA，D6883，Sigma-Aldrich）（Merck KGaA，美國）;共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss LSM 700 Meta，Zeiss，德國）;超氧化物氣化酶（SOD）活性檢測試劑盒（S0109）和RIPA裂解緩沖液（碧云天生物技術研究所，上海）;酶聯免疫吸附試驗（ELSIA）試劑盒（CSB-E08556m， 華美生物，武漢）;BCA蛋白測定試劑盒（Bio-Rad Laboratories，美國）;α-synuclein抗體（ab52168，Abcam，美國）;B淋巴細胞瘤-2基因蛋白（Bcl-2）抗體（05-826）和Bcl-2相關x蛋白（Bax）抗體（MAB4601）（EMD Millipore，美國）;兔抗小鼠IgG-辣根過氧化物酶二抗（sc-358914，Santa Cruz Biotechnology，美國）;谷胱甘肽（GSH，70-18-8，Sigma-Aldrich，Merck KGaA，美國）;α-synuclein 過表達的重組pcDNA3.1+質粒（pcDNA-α-synuclein）及pcDNA3.1+空質粒陰性對照（pcDNA-NC）構建（吉凱基因醫學科技股份有限公司，上海）;膜聯蛋白V（Annexin V，AV）-異硫氰酸熒光素（FITC）細胞凋亡檢測試劑盒（KGA106，江蘇凱基生物技術股份有限公司，南京）;結合緩沖液（00-4222-57，Thermo）。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養和處理分組將MES23.5細胞培養于含有體積分數0.05胎牛血清的DMEM/F12培養基，置37 ℃含體積分數0.05 CO2濕潤培養箱。將MES23.5細胞分為5組。空白對照組（①組）：無處理。pcDNA-NC組（②組）：細胞培養4 h后用空載質粒處理4 h。α-synuclein過表達組（pcDNA-α-synuclein，③組）：用細胞培養液培養4 h以重組質粒pcDNA-α-synuclein處理24 h。α-synuclein過表達+H2O2組（H2O2+pcDNA-α-synuclein，④組）：用H2O2處理后的細胞培養液培養4 h后再以重組質粒pcDNA-α-synuclein轉染24 h。α-synuclein+GSH（GSH+pcDNA-α-synuclein，⑤組）：用GSH處理后細胞培養液培養4 h后以重組質粒pcDNA-α-synuclein轉染24 h。重復6次。

1.2.2流式細胞術檢測凋亡率用AV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒分析樣品凋亡變化。收集細胞，用冰冷PBS洗滌2次，以結合緩沖液（500 μL）懸浮細胞。隨后，細胞用AV-FITC試劑和碘化丙啶（PI）染色。在FACS Calibur流式細胞儀上通過Cell Quest軟件計算細胞的凋亡率。

1.2.3細胞活性氧（ROS）水平檢測使用熒光染料DCFDA檢測ROS水平。將MES23.5細胞以每孔2×104的密度接種在96孔細胞板中。將細胞與2.5 μmol/L的DCFDA在37 ℃下孵育15 min。然后，通過Car Zeiss共聚焦顯微鏡分別在485 nm激發和535 nm發射波長下獲得DCFDA熒光。利用共聚焦激光掃描顯微鏡自帶的ZEN 2008軟件計算ROS的相對含量。

1.2.4細胞內SOD活力檢測收集MES23.5細胞，使用冷的PBS溶液勻漿細胞，4 ℃離心后，取上清作為待測樣品，并嚴格按照總SOD活性檢測試劑盒說明檢測其活力。

1.2.5ELSIA檢測相關細胞因子收集MES23.5細胞培養物的上清液。采用相應試劑盒分別檢測白細胞介素（IL）-6、IL-1β和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的含量。

1.2.6Western blot法檢測Bcl-2和Bax蛋白的表達使用RIPA裂解緩沖液進行總蛋白提取。使用BCA試劑盒檢測蛋白質的濃度。通過SDS-PAGE（120 g/L分離膠，40 g/L濃縮膠）分離蛋白樣品（每泳道20 μg），轉移到聚偏二氟乙烯膜上。室溫下使用50 g/L脫脂牛奶將膜封閉1 h，隨后在4 ℃下與α-synuclein抗體（1∶600）、Bax抗體（1∶200）和抗體Bcl-2（1∶500）反應。將膜與兔抗小鼠IgG-辣根過氧化物酶二抗（1∶5 000）在室溫下再孵育2 h。隨后，將膜用Tris緩沖液和聚山梨醇酯20洗滌7次（每次3 min）。化學發光信號使用增強的化學發光檢測試劑進行顯色。使用Image J 1.4軟件分別計算α-synuclein、Bcl-2及Bax蛋白的相對表達量。

1.3統計學處理

使用Graph Pad Prism 6.0軟件進行統計分析。計量資料數據以±s表示，3組間均數比較用單因素方差分析，均數間兩兩比較采用q檢驗（SNK法，Student-Newman-Keuls）。以Plt;0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1α-synuclein過表達對細胞凋亡的影響

Western blot檢測結果表明，與空白對照組和pcDNA-NC組相比較，pcDNA-α-synuclein組中α-synuclein的表達上調，差異具有統計學意義（F=241.251、249.163，q=4.254～36.771，P<0.05），pcDNA-NC組與空白對照組之間無明顯差異（P>0.05）。過表達α-synuclein效率檢測結果見圖1A、表1。細胞凋亡率檢測結果表明，與空白對照組和pcDNA-NC組相比較，pcDNA-α-synuclein組凋亡率明顯增加，差異具有統計學意義（F=233.214、316.201，q=6.725～41.202，P<0.05）;另外，空白對照組與pcDNA-NC組相比，凋亡率差異無顯著意義（P>0.05）。見圖1B、表1。

2.2α-synuclein過表達對Bax/Bcl-2表達影響

Western blot的檢測結果表明，與空白對照組和pcDNA-NC組相比較，pcDNA-α-synuclein組中Bax表達和Bax/Bcl-2蛋白表達比值上調，而Bcl-2蛋白表達下調，差異有統計學意義（F=266.891～426.347，q=7.044～37.451，P<0.05）;空白對照組與pcDNA-NC組的Bax、Bcl-2蛋白表達和Bax/Bcl-2蛋白表達量均無明顯差異（F=0.014～0.052，q=2.142～4.477，P>0.05）。見圖2、表1。

2.3α-synuclein過表達對細胞SOD活力和ROS含量影響

與空白對照組和pcDNA-NC組比較，pcDNA-α-synuclein組中ROS含量上調，而SOD活力下調，差異具有統計學意義（F=198.523、188.544，q=6.261～35.668，P<0.05）;空白對照組與pcDNA-NC組的ROS含量和SOD活力均無明顯變化（P>0.05）。見表2。

2.4α-synuclein過表達對細胞IL-6、IL-1β以及TNF-α水平影響

炎癥反應檢測表明，與空白對照組和pcDNA-NC組相比較，pcDNA-α-synuclein組IL-6、IL-1β和TNF-α水平均明顯增加，差異具有統計學意義（F=201.33～315.52，q=3.256～36.214，P<0.05）;另外，與空白對照組相比，pcDNA-NC中IL-6、IL-1β、TNF-α水平均無明顯變化（F=0.088～0.245，q=1.014～2.331，P>0.05）。見表2。

2.5細胞氧化損傷對細胞α-synuclein表達和凋亡影響

本文的檢測結果表明，pcDNA-α-synuclein組、H2O2+pcDNA-α-synuclein組和GSH+pcDNA-α-synuclein組α-synuclein表達量分別為0.999±0.087、1.932±0.207和0.623±0.076，細胞的凋亡率分別為（14.336±2.328）%、（22.667±2.541）%和（15.667±2.541）%。與pcDNA-α-synuclein組比較，H2O2+pcDNA-α-synuclein組α-synuclein表達增加，而GSH+pcDNA-α-synuclein組α-synuclein表達降低，差異有統計學意義（F=268.41，q=11.218、41.205，P<0.05）。與pcDNA-α-synuclein比較，H2O2+pcDNA-α-synuclein組中細胞凋亡增加，差異具有統計學意義（F=159.25，q=21.362，P<0.05），而GSH+pcDNA-α-synuclein組細胞凋亡無明顯變化（P>0.05）。

3討論

PD的特征是黑質中多巴胺能神經元的進行性及不可逆性丟失。該病是繼AD之后的第二大最常見的神經退行性疾病[11]。研究表明，α-synuclein參與了多種生物過程，包括神經退行性疾病的發病機制和腦功能異常等[12]。synuclein家族包括α-、β-和γ-synuclein以及突觸膠，α-synuclein是其家族中的高豐度蛋白。盡管它們可能在神經可塑性和對神經元細胞損傷的反應中起重要作用[13]，但是這些蛋白質的確切生理作用尚不清楚。

α-synuclein是一種具有聚合成低聚物潛力的蛋白質，其過表達可促進多種細胞系和動物模型中凋亡細胞的死亡[14]。α-synuclein的表達被認為是重金屬誘導神經毒性的關鍵因素。在錳處理的小鼠體內發現伴隨α-synuclein的積聚增加，氧化應激標志物ROS水平的同時升高并導致SOD活力的減低以及氧化損傷增強。而且研究已表明，氧化應激誘導α-synuclein的翻譯后修飾并促進α-synuclein積聚[15]。這表明α-synuclein和氧化應激存在協同調節作用。另有研究結果表明，在表達α-synuclein的神經元細胞中發現了與家族性PD相關的基因突變（A30P和A53T），導致細胞對氧化應激分子的敏感性增加[16]。本文結果顯示，過表達α-synuclein的多巴胺能神經元中ROS含量明顯升高，而抗氧化劑SOD活力降低。表明α-synuclein可能提高多巴胺能神經元的氧化應激敏感性從而增加氧化傷害。

氧化應激損傷在PD的發病機制中起核心作用[17]，而且異常表達的α-synuclein在細胞內的長期積累能促進氧化應激損傷和線粒體改變，可能導致多巴胺能神經元凋亡和死亡增加[18]。本研究結果進一步證實，在多巴胺能神經元中過表達α-synuclein可誘導細胞的凋亡，并導致Bax/Bcl-2比值的升高。Bcl-2和Bax這兩種蛋白是細胞凋亡的重要調節劑，Bax/Bcl-2比值的增加可導致促凋亡蛋白從線粒體釋放到細胞質，增加細胞的凋亡[19]。此外，最近已證明α-synuclein被miRNA-7靶向抑制后，多巴胺能神經元細胞的凋亡減少[20]。另外，α-synuclein基因敲低可改善脊髓損傷大鼠的神經細胞損傷[21]。在體外和體內的實驗結果已表明，抑制α-synuclein的表達可以抑制細胞凋亡并促進神經再生[22]。提示α-synuclein在細胞中的表達增加可能是PD病變中多巴胺能神經元凋亡和死亡的關鍵原因，且與Bax/Bcl-2比值增加有關。

多種細胞過程如神經細胞凋亡、神經炎癥、線粒體功能障礙等的協同作用參與PD病人神經細胞損傷的發展[12，23]。本研究中除證實α-synuclein可以誘導多巴胺能神經元的凋亡和ROS增加外，還顯示α-synuclein過表達能增強多巴胺能神經元的促炎癥反應，在過表達α-synuclein多巴胺能神經元的培養上清中，觀察到IL-6、IL-1β和TNF-α等水平都明顯上調。表明α-synuclein不僅誘導氧化應激損傷，而且可能介導多巴胺能神經元的促炎癥反應增強，從而加重神經元細胞的損傷。

ROS的過量產生和氧化應激的誘導已被證明與PD相關，并導致多巴胺能神經元細胞死亡和凋亡[24]。近期的研究結果已表明，miRNA-7靶向抑制α-synuclein后可減輕多巴胺能神經元細胞的凋亡和氧化損傷[25]。本文結果也表明，使用GSH處理α-synuclein過表達的多巴胺能神經元細胞，不僅可抑制α-synuclein蛋白表達，而且使細胞凋亡率降低。說明抑制α-synuclein表達與多巴胺能神經元細胞的氧化損傷減弱有關。另外，體外實驗結果也表明，體外神經元細胞的氧化損傷中α-synuclein的表達異常增加[26]。而本研究證實，H2O2進一步促進了α-synuclein過表達的多巴胺能神經元細胞中α-synuclein表達水平，提高其凋亡率。表明氧化應激可能具有強化α-synuclein凋亡誘導的功能，進一步加強多巴胺能神經元細胞的損傷。

綜上所述，α-synuclein對多巴胺能神經元損傷具有促進作用，而多巴胺能神經元的氧化損傷可加重α-synuclein對細胞內ROS、促炎癥因子和細胞凋亡的誘導作用。本研究豐富了PD的發病機制探索的理論基礎，為PD的診斷和治療提供了潛在靶標。但本研究仍存在一些缺陷，今后需要在PD動物模型體內驗證α-synuclein對多巴胺能神經元損傷的調節作用。

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（本文編輯 于國藝）