電化學(xué)方法檢測(cè)血漿游離DNA甲基化水平與甲狀腺癌診斷以及相關(guān)臨床特征的關(guān)系

闞志文 黃子杰 崔亞云 錢(qián)立庭

1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院放療科（合肥230001）；2南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院（廣州510515）

甲狀腺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤，甲狀腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及侵犯與預(yù)后密切相關(guān)［1-2］，所以甲狀腺癌的早篩極為重要，當(dāng)前的首選早篩方法為超聲。目前，液體活檢正受到醫(yī)學(xué)界的關(guān)注，基于PCR 以及測(cè)序技術(shù)的cfDNA甲基化檢測(cè)成為新的焦點(diǎn)［3-4］，其具有時(shí)間長(zhǎng)、耗費(fèi)高等缺點(diǎn)。SINA，Abu Ali Ibn，等人開(kāi)發(fā)出一種基于電化學(xué)的檢測(cè)方法，具有快捷靈敏廉價(jià)等優(yōu)勢(shì)，但沒(méi)有進(jìn)行甲狀腺癌相關(guān)檢測(cè)。本研究通過(guò)電化學(xué)方法對(duì)甲狀腺癌、甲狀腺良性病變與正常人血漿cfDNA 進(jìn)行檢測(cè)分析，在參照正常血漿cfDNA 基礎(chǔ)上評(píng)估甲狀腺良性病變、甲狀腺癌的電流吸附率水平，初步探討其在甲狀腺癌中的診斷價(jià)值和效能以及與甲狀腺結(jié)節(jié)TI-ADRS 分級(jí)、臨床病理特征等關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料甲狀腺結(jié)節(jié)患者納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）超聲診斷甲狀腺結(jié)節(jié)TI-RADS分級(jí)為2級(jí)以上；（2）初次就診，此前未經(jīng)手術(shù)。放化療及生物治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）甲狀腺疾病治療后的患者；（2）罹患其他類型癌癥；（3）沒(méi)有確切病理診斷的患者。正常人納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）沒(méi)有患癌史；（2）體檢無(wú)異常占位及結(jié)節(jié)病。最終納入2019年3-7月于安徽省腫瘤醫(yī)院的甲狀腺結(jié)節(jié)患者149 例，其中甲狀腺癌患者114 例，年齡（38.8 ± 13.4）歲；良性病變者35例，年齡（49.8±12.6）歲；來(lái)自中山大學(xué)腫瘤防治中心體檢正常人血漿35 例作為對(duì)照組，年齡（36.9 ±10.1）歲。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 電化學(xué)工作站及電化學(xué)相關(guān)材料高通量全自動(dòng)化核酸提取站（奧美泰克），電化學(xué)工作站（辰華chi660e），配備金電極，鉑電極，銀電極以及電極打磨機(jī)（Gaoss Union），亞鐵氰化鉀和鐵氰化鉀，超聲清洗儀。

1.2.2 DNA提取相關(guān)試劑來(lái)自天根（tiangen）生化科技公司的DNA 提取試劑：Proteinase K，Buffer A，異丙醇-鹽酸胍混合物，EB 洗脫液等。

1.3 方法收集所有患者的血漿樣本，并提取血漿DNA，使用電化學(xué)方法測(cè)得每個(gè)患者的血漿cfDNA 電流吸附率水平，取樣本血漿0.5 mL，利用高通量全自動(dòng)化核酸提取站（奧美泰克）提取血漿cfDNA，置于磁力板上吸取上層cfDNA 清液35微升轉(zhuǎn)入1.5 mL EP 管中，放入金電極10 min，電解池為超聲打磨過(guò)鉑電極，銀電極，電解液為亞鐵氰化鉀和鐵氰化鉀溶液（200 mL 純水，亞鐵氰化鉀0.211 g，亞鐵氰化鉀0.162 g），將鉑電極、銀電極及金電極放入電解池中分別連接電化學(xué)工作站，采用循環(huán)伏安法檢測(cè)，氧化峰在0.2 V，基線電流取5.3 ～5.63e 之間，DNA 的吸附率計(jì)算公式為DNA電流吸附率=（基線電流-測(cè)量電流）∕基線電流×100%，測(cè)量三次取平均值（圖1）。以病理結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，將被檢測(cè)樣品分為正常組（NC 組），甲狀腺良性病變組（BC 組）和甲狀腺癌組（TC 組），分別檢測(cè)三組的吸附率并記錄（圖2）。根據(jù)甲狀腺癌診療規(guī)范（2018 版）TI-DARS 分類，本批甲狀腺癌根據(jù)超聲將結(jié)節(jié)分為2 類、3 類、4a 類、4b 類、4c 類、5 類、6 類，觀察不同分類結(jié)節(jié)DNA 電流吸附率情況。根據(jù)甲狀腺癌診療規(guī)范（2018 版）將癌灶大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、局部侵犯、多中心性、TNM 分期等影響腫瘤預(yù)后的因素納入統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，觀察與血漿DNA 電流吸附率關(guān)系。

圖1 血漿cfDNA（游離DNA）電流吸附情況示意圖Fig.1 Schematic diagram of plasma cfDNA（free DNA）current adsorption

圖2 TC 組、BC 組及NC 組吸附率Fig.2 Adsorption rate of TC group，BC group and NC group

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以病理結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)量資料采用（）表示。組間比較采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血漿cfDNA 電流吸附率水平診斷甲狀腺癌的效能評(píng)價(jià)采用受試者工作特征（ROC）曲線分析；ir 值與TI-RADS 分級(jí)的檢驗(yàn)采用秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ir 值與甲狀腺癌多項(xiàng)病理特征采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；運(yùn)用Logistic 回歸分析對(duì)甲狀腺癌血漿cfDNA電流吸附率水平等因素進(jìn)行分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TC、BC、NC 組樣本一般特征比較TC（甲狀腺癌）組114 例，其中男28 例，女86 例，年齡為（38.8 ± 13.4）歲；BC（甲狀腺良性病變）組35 例，其中男8 例，女27 例，年齡為（49.8 ± 12.6）歲：NC（正常對(duì)照）組35 例，其中男14 例，女21 例，年齡為（36.9 ± 10.1）歲，3 組性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），年齡差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 DNA 電流吸附率對(duì)甲狀腺癌的早期診斷具有一定的意義TC 組與NC 組ir值的ROC 曲線下面積為0.723，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；TC與BC 組ir值的ROC 曲線下面積為0.778，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；BC 與NC 組ir值的ROC 曲線下面積為0.384，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.094），3 組檢測(cè)靈敏度為61.4%，特異度為68.6%，準(zhǔn)確度為64.1%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖3-5。

圖3 TC 組與NC 組ir 值診斷甲狀腺癌的ROC 曲線Fig.3 ROC curve of thyroid cancer diagnosed by IR value in TC group and NC group

2.3 甲狀腺癌組與良性結(jié)節(jié)組的TI-DARS 分級(jí)與吸附率情況比較以cutoff 值29 為界，將吸附率（ir）分為＜29 組和≥29 組，兩組的TI-DARS 分級(jí)情況比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。ir 值≥29組TI-ADRS 分級(jí)4c、5級(jí)比例顯著高于ir值＜29組；ir值＜29組TI-ADRS 分級(jí)3 級(jí)比例顯著高于ir 值≥29 組，在4a、4b 級(jí)中，兩組比例相差不大（表1）。

圖4 TC 組與BC 組ir 值診斷甲狀腺癌的ROC 曲線Fig.4 ROC curve of ir value in thyroid cancer diagnosis between TC group and BC group

圖5 BC 組與NC 組ir 值的ROC 曲線Fig.5 ROC curve of ir value of BC group and NC group

2.4 甲狀腺癌組中腫瘤臨床病理特征與甲狀腺癌吸附率情況分析以cutoff 值29 為界，將吸附率（ir%）分為＜29 組和≥29 組，在癌灶大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、局部侵犯、多中心性中的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

2.5 關(guān)于甲狀腺癌的Logistic 回歸分析將ir 值（≥29=1，＜29=0）、年齡、性別（女=0，男=1）作為自變量，以甲狀腺結(jié)節(jié)最終診斷為因變量（甲狀腺癌=1，良性結(jié)節(jié)=0）進(jìn)行Logistic 回歸進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)ir 值≥29 回歸系數(shù)=0.257，OR= 1.293，ir 值≥29 是甲狀腺癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，ir 值越高，甲狀腺癌風(fēng)險(xiǎn)越大（P＜0.01），見(jiàn)表3。

3 討論

甲狀腺癌多發(fā)于青壯年，早期無(wú)明顯癥狀，大多表現(xiàn)為甲狀腺結(jié)節(jié)，現(xiàn)有的早篩手段主要是超聲，而在超聲診斷的高危結(jié)節(jié)中，仍有很大一部分是良性病變，結(jié)構(gòu)性檢查（FNA）是甲狀腺癌檢查的金標(biāo)準(zhǔn)［5-7］，利用細(xì)針對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)進(jìn)行穿刺，從中獲取細(xì)胞成分，通過(guò)細(xì)胞學(xué)診斷對(duì)目標(biāo)病灶性質(zhì)進(jìn)行判斷。但超聲引導(dǎo)下穿刺活檢存在一些限制，如有出血、感染風(fēng)險(xiǎn)，穿刺針途徑可能損傷臨近重要器官，限制女性經(jīng)期等［8］。甲狀腺癌的液體活檢相比于結(jié)構(gòu)性檢查有著創(chuàng)傷性小的優(yōu)點(diǎn)，其中甲基化的研究是當(dāng)下的熱門(mén)領(lǐng)域。甲基化是真核生物基因表達(dá)調(diào)控方式，也是一種特有的表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象。基因的高甲基化也參與了多種腫瘤的形成發(fā)生與發(fā)展［9-11］，DNA 的甲基化水平在國(guó)外有些學(xué)者的研究中也成為影響甲狀腺癌預(yù)后的新的評(píng)價(jià)指標(biāo)［12］。隨著近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的學(xué)者對(duì)循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）的研究日益增多，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)血液中ctDNA 的含量有助于甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)的鑒別診斷［13］。高甲基化水平ctDNA 也被認(rèn)為是肝癌診斷和預(yù)后的重要分子標(biāo)記物［14］。甲狀腺癌患者的臨床病理特征決定了術(shù)后甲狀腺癌患者的進(jìn)一步治療方案，DNA 的甲基化水平有望與甲狀腺癌患者眾多的臨床病理特征一樣成為指導(dǎo)甲狀腺癌患者治療的一項(xiàng)指標(biāo)［15］。當(dāng)前DNA 甲基化檢測(cè)主要是基于PCR以及二代測(cè)序等技術(shù)，有耗時(shí)長(zhǎng)且繁瑣、技術(shù)要求高、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)［16］。因此亟需一種新型的血漿cfDNA 甲基化檢測(cè)技術(shù)。SINA等［17］發(fā)現(xiàn)了啟動(dòng)子區(qū)高甲基化基團(tuán)DNA在金表面會(huì)聚集成團(tuán)的特性，并以此用來(lái)檢測(cè)乳腺癌等癌癥患者血漿中的cfDNA 電流吸附率水平，以此來(lái)衡量乳腺癌等癌癥中啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平。電化學(xué)作為一種新興的檢測(cè)方法，有著快速、簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)，既往文獻(xiàn)中沒(méi)有類似的甲狀腺癌血漿cfDNA 吸附率檢測(cè)方法對(duì)甲狀腺癌的早期診斷的報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)血漿cfDNA 電流吸附率水平（ir 值）對(duì)甲狀腺癌的早期診斷具有一定的意義；甲狀腺癌cfDNA 的ir 值在TI-RADS 分級(jí)中差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），甲狀腺癌高吸附率水平（ir ≥29）在TI-RADS 分級(jí)高組的比例明顯高于低級(jí)組。本研究中ir 值≥29 組與＜29 組在癌灶大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、局部侵犯、多中心性、TNM 分

期等甲狀腺癌病理特征中的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。經(jīng)過(guò)分析發(fā)現(xiàn)ir 值≥29 是甲狀腺癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素OR=1.244（P＜0.01）。

表1 ir 值相關(guān)的TI-DARS 分級(jí)情況Tab.1 Ir value related Ti-DARs grading 例（%）

表2 ir 值與各病理特征之間的相關(guān)性分析Tab.2 Correlation analysis between IR value and pathological features例

表3 甲狀腺癌危險(xiǎn)因素的logistic 回歸分析Tab.3 Logistic regression analysis of thyroid cancer risk factors

本研究也具有一定的局限性，甲狀腺微小乳頭狀癌（papillary thyroid microcarcinoma，PTMC）的cfDNA 電流吸附率較低，由于大多數(shù)PTMC 是一種惰性疾病，腫瘤發(fā)展有限，大多數(shù)情況下甚至不生長(zhǎng)發(fā)展［18］，分析原因可能是釋放入血漿的高甲基化水平的cfDNA 量有限，影響cfDNA 電流吸附率，進(jìn)而對(duì)本研究的檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響。

血漿cfDNA 電流吸附率水平（ir 值）對(duì)甲狀腺癌的診斷具有一定的意義；ir 值在癌灶大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、局部侵犯、多中心性、TNM 分期等甲狀腺癌病理特征中的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；ir ≥29 是甲狀腺癌的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素；ir 值與TI-ADRS 分級(jí)相關(guān)。本研究結(jié)果對(duì)甲狀腺癌早期診斷，判斷預(yù)后及給予臨床后續(xù)治療有著一定的參考作用。