竹粉酶解液發酵產γ - 聚谷氨酸研究

吳建鑫，關常道，孫苗苗，韋張其，周春陽，劉國慶

（合肥工業大學 食品與生物工程學院，安徽 合肥 230061）

γ-PGA 是一種由DL 谷氨酸通過α - 氨基和γ -羧基通過γ 酰胺鍵結合而成的陰離子聚合物[1]，在微生物相關基因cap（Capsule） 和pgs（Polyglutamate synthase） 調控表達的γ-PGA 合成酶下，將不同構型的谷氨酸合成不同構型的γ-PGA[2]。經γ-PGA 因其具有生物相容性、可生物降解性、水溶性、可食性、無毒性和環境友好性而備受關注，在食品加工、化妝品、醫學、廢水處理等方面都有應用，其應用廣泛且需求巨大[3]。全球森林面積約22.39 億hm2，其中竹林面積約8 879 萬hm2，尤其中國的竹資源達到世界的1/3，每年可砍伐毛竹4 億多枝，雜竹300 多萬t，相當于1 000 余萬m3木材的量，占中國每年木材采伐量的1/5 左右，原料豐富。竹子作為一種優良的纖維原料，其主要化學組分是纖維素、半纖維素和木質素，一般來講，竹子由50%～70%的全纖維素、30%的戊聚糖和20%～25%的木素組成，竹子的化學成分在不同的屬種之間會有一些差別[4-5]，微生物不能直接利用竹子產γ-PGA，所以對竹子的前處理探討也有重要意義。由此可見，對以綠色原料產γ- PGA 的工藝研究具有重要的意義。

以葡萄糖、蔗糖、檸檬酸等為碳源，經枯草芽孢桿菌合成γ-PGA 的傳統試驗，結果表明γ-PGA 的產量可達20.8 g/L[6]。現在也有一些以玉米小麥等秸稈合成γ-PGA 的研究[7-8]，試驗合成的γ-PGA 產量達20～25 g/L[9]。而以竹子作為原料生產γ-PGA 的文獻還未被報道。由于竹子中的纖維結構復雜、密度大，為了增大反應的接觸面積，需要先對原料竹進行預處理和糖化。常用預處理的方法包括物理處理法、化學處理法、酶處理和微生物處理等，其中物理處理法有機械膨化、蒸汽爆破、熱水抽提、微波等[10-12]；化學處理法有稀酸或稀堿處理，如氨水處理、NaOH 處理、稀硫酸處理等[13-14]；酶處理的酶主要有降解纖維素的纖維素酶、降解半纖維素的木聚糖酶和降解木質素的漆酶；生物處理法在生物預處理中，白腐菌、褐腐菌和軟腐菌等微生物常被用來降解木質素和半纖維素，其中最有效的白腐菌是擔子菌類[15]。在前處理的過程中，氫氧化鈣預處理對秸稈的酶解糖化效率達60.38%[16]，氨法預處理秸稈的酶解糖化后，還原糖質量分數達68.78%[7]，預處理可以明顯提高糖液中的還原糖含量。試驗常聯合不同的預處理方法，后期的糖化效果更好[17]。張強等人[18]也對木糖異構酶降解秸稈的條件進行探究，確定了適合酶降解的條件。王振強等人[19]也探究了納豆芽孢桿菌利用葡萄糖發酵的相關條件。糖化過程傳統方法常使用纖維素、木聚糖酶、漆酶等，復合酶的糖化率更高，試驗先對已粉碎的竹粉進行稀堿預處理，然后分不同時段加入纖維素酶、木聚糖酶和木糖異構酶得到糖化液，分別探討了該復合酶系得到的糖化液還原糖含量，以及不同碳源和各前體物質對γ-PGA 生產的影響。對添加發酵酶系的探究，擬定了一條以竹粉原料發酵聚谷氨酸的較優方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種和培養基

枯草芽孢桿菌，市售納豆菌經分離純化得到。

種子培養基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化鈉5 g/L，pH 值7.0～7.2；于121 ℃下滅菌20 min。

發酵培養基：葡萄糖40 g/L，酵母膏6 g/L，谷氨酸鈉30 g/L，NH4Cl 3 g/L，K2HPO4·3H2O 2 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，pH 值7.0～7.2；于121 ℃下滅菌20 min。

1.1.2 儀器與設備

WHY-2 型水浴恒溫振蕩器、數顯生化培養箱，常州國宇儀器制造有限公司產品；Multifuge X1 型高速離心機，美國Thermo 公司產品；高速粉碎機，上海艦艇工貿有限公司產品；FA1004C 型分析天平，上海越平科學儀器公司產品；電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司產品；HH-4 型數顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司產品；立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器，合肥華泰醫療設備有限公司產品。

1.1.3 試劑

水竹購自安徽宣城，40 ℃下烘材料12 h 后，粉碎成100 目；谷氨酸鈉購自市售蓮花牌袋裝味精，谷氨酸鈉含量≥99.9%；氫氧化鈉（AR），無錫佳妮化工試劑有限公司提供；苯酚（AR）、酒石酸鉀鈉（AR），國藥集團化學試劑有限公司提供；亞硫酸鈉（AR）、3,5 - 二硝基水楊酸、木聚糖酶，阿拉丁生化科技（上海） 股份有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 竹子的預處理和糖化液制備

（1） 預處理。堿法預處理，稱取10 g 干燥竹粉，加入氨水溶液，放入微波爐中，處理條件為700 W，6 min；水浴搖床70 ℃，24 h，120 r/min。

（2） 糖化液的制備。用0.1 mol/L 的檸檬酸溶液調節預處理后的竹粉，使pH 值至5.0，于50 ℃下以轉速150 r/min糖化72 h，每隔24 h 分別加入纖維素酶、木聚糖酶和木糖異構酶，用量均為0.03 g，酶解得到糖化液。

1.2.2 γ- PGA 的發酵

（1） 菌種活化。將斜面培養基的菌種轉接到種子培養基，溫度37 ℃，轉速150 r/min，置于搖床上培養24 h。

（2） 發酵。將活化后的種子培養液按2%的接種量接種至裝液量為50 mL 的250 mL 發酵培養基，轉速150 r/min，溫度37 ℃，置于搖床上培養48 h。

1.2.3 檢測方法

（1） γ-PGA產量測定。將發酵液以轉速6 000 r/min離心20 min 除去菌體，取上清液加入15 mL 乙醇沉淀，以轉速6 000 r/min 離心20 min，將沉淀置于40 ℃恒溫干燥箱烘干后稱量。

（2） 竹子糖液還原糖含量測定。用3,5 - 二硝基水楊酸法（DNS 法） 測定。

1.2.4 數據分析

采用Origin 9.0 進行作圖，Excel 數據分析極差。

2 結果與分析

2.1 木糖異構酶用量對酶解的單因素試驗

取10 g 竹粉經預處理后，調節pH 值至5.0，溫度為50 ℃，以轉速150 r/min 反應72 h，加入纖維素酶、木聚糖酶0.03 g，木糖異構酶用量為0，0.01，0.02，0.03，0.04 g 酶解后離心，取上清液測定還原糖含量。

木糖異構酶用量對酶解的影響見圖1。

由圖1 可知，木糖異構酶的添加對竹粉的酶解有促進作用。

2.2 竹子糖液還原糖含量的分析

通過DNS 還原糖分析，測得所制得的竹子糖液還原糖質量濃度為16.9±3.3 g/L。對比趙宗凱等人[17]所得的還原糖質量濃度最高可得42.37 g/L，優化試驗制糖工藝。

圖1 木糖異構酶用量對酶解的影響

2.3 不同碳源對γ-PGA 產率的影響

作為微生物生長所必需的物質，碳源能為微生物的生長提供能量，因此選擇合適的碳源對于γ-PGA 發酵生產具有重要的作用。分別使用添加量為2%的竹糖、葡萄糖、蔗糖、檸檬酸、可溶性淀粉為碳源，固定培養基其他組分進行試驗，通過最終發酵所得γ-PGA 產量比較。

碳源種類對γ-PGA 產量的影響見圖2。

圖2 碳源種類對γ-PGA 產量的影響

由圖2 可以看出，在同樣的添加量下，利用不同的碳源發酵，其γ-PGA 產量有明顯區別。相比其他傳統的碳源，利用竹糖發酵所得的聚谷氨酸產量最高，為28.82 g/L，且差異顯著（p＜0.05）。這說明竹糖中可能含有除了碳源外，其他菌體生長中所需的微量元素和生長因子。這些微量元素和生長因子可能促進了菌體生長和聚谷氨酸的產生。

2.4 碳源、氮源、前體物谷氨酸鈉濃度對γ-PGA 產率的影響

由于不同底物質量濃度，γ-PGA 的產量會有差別，因此通過只改變培養基里葡萄糖、酵母膏、前體物谷氨酸鈉的質量濃度，探究各個底物質量濃度對γ-PGA 產量的影響。

葡萄糖質量濃度對γ-PGA 產量的影響見圖3，有機氮源質量濃度對γ-PGA 產量的影響見圖4，谷氨酸鈉質量濃度對γ-PGA 產量的影響見圖5。

圖3 葡萄糖質量濃度對γ-PGA 產量的影響

圖4 有機氮源質量濃度對γ-PGA 產量的影響

圖5 谷氨酸鈉質量濃度對γ-PGA 產量的影響

由圖3 可以看出，在一定的質量濃度范圍內，葡萄糖質量濃度的增加能夠促進γ-PGA 的生成，但是當質量濃度超過這個范圍則會抑制其產量的增加，當葡萄糖質量濃度超過60 g/L，γ-PGA 的產量增加開始變緩慢。當葡萄糖質量濃度為80 g/L 時，γ-PGA產量達到最大為19.51 g/L；當葡萄糖質量濃度為100 g/L 時，γ-PGA 產量下降至16.71 g/L。因此，初步可以認為在碳源質量濃度為80 g/L 時有最大γ-PGA 產量，初步選用80 g/L 為初步的最佳碳源質量濃度。氮源不僅可以用來轉變為微生物自身的組分，還能用來合成某些目標產物，不同的微生物最適氮源也會不同，而單一的無機氮源通常不能合成較高產量的γ-PGA，因此探究酵母膏質量濃度試驗中，都添加了無機氮源NH4Cl 3 g/L。

由圖4 可以看出，γ-PGA 產量隨著酵母膏質量濃度的增大先升高后下降，在酵母膏質量濃度為6 g/L時達到最大值，初步選用6 g/L 作為最佳氮源質量濃度。谷氨酸作為某些谷氨酸依賴型微生物合成γ-PGA 的合成前體[2]，也參與γ-PGA 其中的一個合成途徑。

由圖5 可以看出，該菌自身在沒有外源添加γ-PGA 的情況下也可以自身合成γ-PGA，在添加谷氨酸鈉后，γ-PGA 的產量隨外源谷氨酸鈉質量濃度的增大而增大，考慮到實際生產的成本，在60 g/L 的質量濃度時，斜率最大，然后逐漸遞減，因此初步選用80 g/L 作為初步的最佳質量濃度。

2.5 正交試驗

通過單因素試驗選擇合適的因素與水平進行了L9（34）的正交試驗設計，以確定最優的發酵工藝條件。

正交試驗設計見表1，正交試驗結果見表2，最優組合下γ-PGA 產量見表3。

表1 正交試驗設計/g·L-1

表2 正交試驗結果

表3 最優組合下γ-PGA 產量/g·L-1

由表2 的極差可以看出，聚谷氨酸發酵生產影響的主次關系依次為D＞A＞B＞C，即谷氨酸鈉質量濃度＞碳源種類＞碳源質量濃度＞有機氮源質量濃度。由正交試驗得出最優方案為A1B3C3D3，即最佳碳源種類為竹糖，碳源質量濃度80 g/L，有機氮源質量濃度8 g/L，谷氨酸鈉質量濃度80 g/L，NH4Cl 3 g/L，K2HPO4·3H2O 2 g/L，MgSO4·7H2O 適量。并以此最優方案得到γ-PGA 產量的3 次結果（見表3），γ-PGA 的平均產量為35.31 g/L。

3 結論

以竹子作為碳源，測得所制得的竹子糖液為混合糖，較單一糖源產γ-PGA 高。確定最佳的聚谷氨酸發酵生產工藝方案，所得聚谷氨酸的產量可以達到35.31 g/L，培養條件可做進一步探究，一方面竹糖液中可能含有影響微生物γ-PGA 聚合酶表達的物質，另一方面所加的木糖異構酶也可能會對聚谷氨酸的合成有影響。我國竹產業豐富，現有預處理和糖化工藝所得竹子糖液中還原糖含量高[18]，具有適合生產聚谷氨酸的可行性和科學性。