蛭龍通脈顆粒聯合西藥干預創傷性肢體深靜脈血栓形成機制的實驗

曲洪雪，劉云鵬，馬俊，丁樂順，張巖，譚慶遠，姜寧

(煙臺市中醫醫院，山東 煙臺 264000)

0 引言

深靜脈血栓(Deep Venous Thrombosis，DVT)形成是指血液在深靜脈系統非正常凝結，堵塞血管，造成血液回流不暢。目前西醫在預防骨科術后深靜脈血栓的常用藥物有阿司匹林、低分子肝素、華法林、利伐沙班等藥物。

小劑量阿司匹林(50～100 mg/d)對抑制血小板活性是有效的，此劑量明顯小于抗炎所需的劑量。但美國ACCP 指南以及中國《預防骨科大手術深靜脈血栓形成指南(草案)》都指出阿司匹林不能單獨用于關節置換術后 DVT 的預防[1,2]，因為阿司匹林與其他藥物相比效果不明顯。華法林是一種口服抗凝藥，有明顯的缺點：首先華法林需36～72 h 達到穩態濃度；其次其有效劑量有個體差異，需要常規監測國際標準化比值 (INR)，控制INR 在2.0-3.0，目標值為2.5，如INR＞3.0 會增加出血并發癥危險。低分子肝素(LMWH)是通過采用各種生物和化學方法對普通肝素進行人工合成，保留了普通肝素獨有的能與抗凝血酶Ⅲ(AT Ⅲ)相結合的戊糖基。低分子肝素對血小板的抑制作用以及對血管通透性增加的影響更小，因此，導致出血并發癥的發生概率也更小[3]。利伐沙班是骨科術后的一種新型抗凝藥。它是一種高選擇性的Xa 因子抑制劑，對血小板聚集沒有直接作用，對預防骨科術后DVT 的療效優于依諾肝素，且安全性與依諾肝素相似。無需監測凝血功能，口服后吸收快，生物利用度達60%～80%，現已成為臨床抗凝的新選擇。但研究表明[14,15]，術后大出血發生率與利伐沙班的劑量呈顯著性相關，且利伐沙班價格較高。

現在普遍的共識認為早期確診是治療DVT 的關鍵，治療時間越早，效果越好，后遺癥越少。非手術治療在臨床中占據DVT 治療的主要地位。但是西藥在治療深靜脈血栓中的上述不足，如：以溶栓抗凝、降纖祛黏為主，起效快，但是極易并發出血事件，且量效關系不確切。中醫藥治療不良反應小，安全性高，對血栓再通及側枝循環的建立都有療效，但是起效慢，易錯過最佳治療時機。因此我們自擬以活血通絡為主要治則的簡單小方劑蛭龍通脈顆粒聯合西藥干預創傷性肢體深靜脈血栓形成，探討一種有效的組方簡單，對DVT 治療行之有效的的方藥。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年Wistar 大鼠，雄性，購買時體重270-300g。購買自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，動物生產許可證號：SCXK(魯)20140007，合格證號：No.37009200002751，動物適應性飼養約1 周左右，自由飲水、攝食。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組

以135 只Wistar 大鼠為研究對象，隨機分為9 組，每組15 只。

假手術對照組(Sham)：按照下腔靜脈造模術的方法分離出下腔靜脈后，不予以結扎，直接關腹，于術后4h 開始每日給予生理鹽水，分別于術后第1、3、6d，每次隨機取5 只大鼠，生理鹽水灌胃2h 后，腹腔麻醉，開腹，腹主動脈取血，取下腔靜脈標本作組織學的觀察。

血栓模型對照組(Model)：下腔靜脈造模術4h 后開始每日給予生理鹽水，分別于術后第1、3、6d，每次隨機取5 只大鼠，生理鹽水灌胃2h 后，腹腔麻醉，開腹，腹主動脈取血，取下腔靜脈標本作組織學的觀察。

蛭龍通脈低劑量組(50mg/kg)：下腔靜脈造模術4h 后開始每日給藥，分別于術后第1、3、6d，每次隨機取5 只大鼠，灌胃給藥2h 后，腹腔麻醉，開腹，腹主動脈取血，取下腔靜脈標木作組織學的觀察。

蛭龍通脈中劑量組(100mg/kg)、蛭龍通脈高劑量組(200mg/kg)、肝素低劑量組(630U/kg)及肝素正常劑量組(630U/kg×2)取材方法及步驟同蛭龍通脈低劑量治療組。

蛭龍通脈與肝素聯用低劑量組(50mg/kg+ 630U/kg)：在蛭龍通脈低劑量治療組基礎上加用低劑量肝素，腹壁皮下注射。

蛭龍通脈與肝素聯用中劑量組(100mg/kg+ 630U/kg×2)：在蛭龍通脈中劑量治療組基礎上加用正常劑量肝素，腹壁皮下注射。

1.2.2 用藥劑量及給藥方式

按照人與動物公斤體重的等效劑量比值進行藥物劑量的折算。蛭龍通脈顆粒常規服用量為100mg/kg，實驗中采用灌胃給藥，低劑量為50mg/kg，配置濃度為5mg/mL 的溶液；中劑量為100mg/kg，配置濃度為10mg/mL 的溶液；高劑量為200mg/kg，配置濃度為20mg/mL 的溶液，均則按照10mL/kg 進行給藥，每日一次。依諾肝素鈉采用腹壁皮下注射。依諾肝素使用說明中指出，在低血栓形成風險傾向時應用2000u/24h，血栓形成高風險傾向時應用2000u/12h，以此為依據，我們設計依諾肝素為低劑量按照630U/kg，1 次/24h，正常劑量按照630U/kg，1 次/12h。因蛭龍通脈顆粒破血作用強大，為減少出血事件的發生，取消蛭龍通脈顆粒高劑量與肝素正常劑量聯用，僅設計了低、中劑量與肝素聯用。假手術組和模型組為1mL/100g 生理鹽水，均采用灌胃給藥，每日1 次。

1.2.3 造模方法

參照Reyers 等造模方法，采用下腔靜脈結扎法造模，按照3mL/Kg 體重的標準，腹腔注射10%的水合氯醛進行麻醉，麻醉成功后，仰臥位，將大鼠頭和四肢固定于操作臺上，于劍突下腹部正中，取豎直切口，剪開腹腔，將腸管移出體外，以生理鹽水濕紗布包裹，置于腹部右側。打開后腹膜，仔細游離左腎靜脈與下腔靜脈匯合處及其下方1.0 cm 長下腔靜脈段并用4#縫合線結扎，1#外科非吸收性絲線結扎左腎靜脈水平以遠下腔靜脈段的主要屬支，2mL 生理鹽水注入腹腔中，推腸管入腹腔內，1#絲線依次縫合腹壁及皮膚。術后動物自由飲水，普通全價顆粒飼料飼養，不給予抗凝劑及抗生素。

1.2.4 取材方法

取各治療組及模型組大鼠，麻醉后，腹中部皮膚去毛，常規消毒，鋪巾，沿原切口進腹，將腹腔內腸管移出體外，用生理鹽水濕紗布包裹后置于腹部右側，充分暴露血栓形成的下腔靜脈段。進行腹主動脈取血，而后將下腔靜脈與髂總靜脈匯合處放置顯微血管夾，將左腎靜脈下方結扎線與血管夾之間的下腔靜脈段完整取出，放入固定液中固定以備檢測。假手術組大鼠的下腔靜脈取材方法與模型組相同。

1.2.5 檢測指標

1.2.5.1 血小板聚集率

給藥一定時間后，腹主動脈快速取血，離心上機測血小板聚集率。

1.2.5.2 全血粘度采用血液粘度儀測定，全血測定完后，剩余血樣以3000r/min 離心，進行血漿粘度的測定。

表1 各治療組及對照組血小板聚集率比較(±SD)

表2 各治療組及對照組全血粘度值(200)比較(±SD)

1.2.5.3 切取血栓段血管壁行切片并HE 染色觀察膠原纖維表達情況。

1.2.6 統計方法

本實驗使用統計學軟件SPSS 22.0 對數據進行處理，所有數據以平均值標準差(±SD)來表示。首先采用Levene’s 檢驗法對各組數據方差進行齊性檢驗，方差齊性(P＞0.05)，則采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進行統計分析。如果ANOVA 有統計學意義(P＜0.05)，進一步使用LSD test(參數法)進行組間兩兩比較分析。如果方差不齊(P＜0.05)，則采用Kruskal-Wallis 進行非參數檢驗。如果Kruskal-Wallis 檢驗有統計學意義(P=0.05)，則進一步使用Mann-Whitney U 法進行均數間的兩兩比較。

2 結果

2.1 血小板聚集率

見表1。

2.2 血液粘度檢測結果

見表2-表6。

2.3 HE 染色觀察血管內壁膠原纖維表達情況

HE 染色觀察見，血栓模型靜脈壁中有炎性細胞浸潤，呈散在分布，外膜以外的脂肪組織也受累。炎性細胞以中性粒細胞為主，少量纖維母細胞分布其中，膠原纖維增生，內皮細胞輕度增生，內膜下出現少量空泡細胞，尤以第3 天血栓情況最為嚴重，第6 天血栓模型略有緩解；治療組，蛭龍通脈顆粒中、高組在72 小時之后作用較為明顯，中性粒細胞浸潤減少，膠原纖維顯著減少，蛭龍通脈與肝素聯用低劑量及中劑量組能夠在術后24 內即有效減少膠原纖維，且使其炎性細胞浸潤減少。

表3 各治療組及對照組全血粘度值(30)比較(±SD)

表4 各治療組及對照組全血粘度值(5)比較(±SD)

表5 各治療組及對照組全血粘度值(1)比較(±SD)

3 結論

3.1肝素在血栓形成早期(72 小時內)治療中療效優于蛭龍

表6 各治療組及對照組血漿粘度值(200)比較(±SD)

3.2蛭龍通脈顆粒聯合肝素注射液對深靜脈血栓形成具有良好的抗凝、溶栓作用，通過改善血液的高凝狀態，降低血液粘度達到治療血栓作用；

3.3蛭龍通脈顆?？赡芡ㄟ^抑制血小板聚集，改善血液流變學，來抑制與治療深靜脈血栓形成；

3.4本次研究證明蛭龍通脈顆粒劑與依諾肝素注射液聯用對大鼠深靜脈血栓模型有較好的治療效果，并優于各藥單用，或為未來臨床治療深靜脈血栓以及相關的其他疾病提供一個較好的實驗基礎和前景。

4 討論

Vichow 在1856 年提出Vichow“三聯征”理論[6]，即：①血流狀態的改變。②血管內膜損傷。③血液高凝狀態是對下肢DVT 發病機制的最早認識。

創傷后機體凝血機制發生變化，血液粘度的增加則導致靜脈血栓形成的危險性增加。下肢嚴重創傷體內血管損傷出血，止血中血小板止血栓子的形成要經過血小板黏附與聚集兩個過程[7]。血小板聚集功能是評估抗血小板藥物療效的重要指標，臨床上普遍將經ADP 誘導的血小板聚集率作為評價抗血小板治療的有效性指標[8]。血小板聚集率升高時，血小板容易聚集形成血栓，其數值越高，形成血栓的可能性越大。通過治療，血小板聚集率降低時，不但可以抑制血栓形成，還會使已形成的血栓溶解，因此測定血小板聚集率可以有效觀察療效、篩查藥物的作用。血小板聚集率結果顯示：說明蛭龍通脈顆粒劑能顯著抑制血栓形成中血小板的聚集，從而抑制血栓形成，其中蛭龍通脈與肝素聯用低、中劑量抑制血小板聚集的作用明顯優于單純肝素組正常劑量。

創傷后血液流變學各指標之間并不是孤立的，而有著密切的聯系，全血粘度是指單位HCT 所引起的血液粘度，因而能更直接的表達血液粘度受紅細胞聚集性影響的情況。血漿粘度是影響全血粘度的中藥因素之一，血漿粘度升高全血粘度必然增高，其影響因素主要取決于血漿蛋白，尤其是纖維蛋白原、脂蛋白和球蛋白的濃度。全血粘度、血漿粘度反映了血液的粘滯性和濃稠性。Hitosugi M 等所作的實驗結果表明：家兔骨折后的瘀血程度可以用血液流變學指標來反映。本實驗發現術后各手術組血液粘度及血漿粘度均升高，以模型組升高更為顯著，第3 天達高峰，術后第6 天呈下降趨勢。蛭龍通脈顆粒劑中、高劑量以及蛭龍通脈與肝素聯用低、中劑量可以明顯改善血液高凝狀態，減少不同切變率(200，30，5，1)下的血液黏度，從而有效溶解血栓，達到治療效果。

本實驗結果顯示，治療組，蛭龍通脈顆粒中、高組在72 小時之后作用較為明顯，中性粒細胞浸潤減少，膠原纖維顯著減少，而蛭龍通脈與肝素聯用低劑量及中劑量組能夠在術后24 內即刻發揮作用，有效減少膠原纖維，且使其炎性細胞浸潤減少，療效更為突出。

我們結合多年臨床診治經驗，根據骨傷病人氣滯血瘀，脈絡阻塞的病機特點，我們確立了以破血活血、化瘀通絡為主要治則的小方劑：蛭龍通脈顆粒。此方由水蛭、地龍、三七三味藥組成，組方簡單，效果顯著。

水蛭功效為破血逐瘀，用于癥瘕積聚、血瘀經閉及跌打損傷。其破血逐瘀力強，善能消散癥結，通暢血脈?，F代藥理學認為水蛭主要含蛋白質，羅承鋒[9]總結從各種水蛭分離出作用于凝血/纖溶系統的活性成分，其中水蛭素是目前最強的凝血酶抑制劑，具有強大的抗凝作用，它可以使凝血酶失去裂解纖維蛋白的能力，阻止凝血酶催化凝血因子的活化，能阻止凝血因子Ⅴ、Ⅶ的活化及凝血酶誘導的血小板反應。另據袁繼偉[10]報道，水蛭有直接溶解血栓的作用，它既可以與血漿中游離的凝血酶結合，又可以中和與纖維蛋白結合的凝血酶，可以防止血栓的形成和延伸。

地龍具有良好的清熱、熄風止痙之效，而且又具有通經絡之功，宜于熱痹關節紅腫熱痛，屈伸不利者?，F代藥理學認為，蚓激酶可以體外延長血栓形成時間，既抗凝血又不影響止血，可用于各種血管栓塞類疾病的防治。體外實驗證明，地龍提取液具有很好的抗凝作用，能使凝血時間、凝血酶時間、凝血酶原時間均顯著延長，且呈明顯量效關系。何紅等[11]研究表明地龍提取物中所含的游離氨基酸可能是地龍抗凝血作用的主要有效成分。

三七為中醫臨床常用藥，有散瘀止血、消腫定痛等功效。三七，和營止血，通脈行瘀，行瘀血而斂新血，有化瘀和致瘀的雙向調節作用，其特點為止血而不留瘀，化瘀而不傷正，對于出血兼有瘀滯腫痛者尤為適宜?，F代藥理研究顯示，本品含有三七皂苷，五加皂苷，斛皮苷、槲皮素等。三七能縮短凝血時間及縮短凝血酶原時間，它通過機體代謝，誘導血小板釋放凝血物質而產生止血作用。有顯著抗凝、抑制血小板聚集，促進纖溶，降低全血粘度[12]。

從本實驗的結果可以看出，高濃度劑量的蛭龍通脈顆粒單獨應用在術后第三天，即可達到與單獨應用依諾肝素相同的抗凝效果，并顯著降低血管壁中性粒細胞的浸潤。在早期(術后第1 天)，蛭龍通脈顆粒與中、低濃度劑量依諾肝素聯合應用抗凝效果優于單純應用依諾肝素，并未見有出血時間的發生，因此我們建議創傷后或者術后肢體的深靜脈血栓的預防早期(1-3天內)可以蛭龍通脈顆粒顆粒與低濃度的低分子肝素聯合應用，以達到更好的抗凝作用。創傷、術后3 天以后或者病人出院后可單獨應用高濃度劑量的蛭龍通脈顆粒以達到預防深靜脈血栓的作用。從而很好的解決了病人院外使用低分子肝素監測和使用困難，且解決了病人對長期皮下注射用藥依從性差的問題。