著色性干皮病患者的臨床及基因突變分析

韋琴，丁艷

(1.江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430000；2.武漢兒童醫(yī)院，湖北 武漢 430000)

0 引言

著色性干皮病(Xeroderma Pigmentosum，XP)是一種罕見的常染色體隱性遺傳皮膚病，發(fā)病率約為1-1.65/10 萬，1874 年由皮膚科醫(yī)生Moriz Kaposi 首次報道[1]。患兒多在出生后6 個月至3 歲發(fā)病，臨床表現(xiàn)為皮膚對日光特別是紫外線高度敏感，暴露部位皮膚出現(xiàn)色素沉著、干燥、角化、萎縮及癌變[2]；由于皮膚癌變和神經(jīng)退行性后遺癥，XP 患者的壽命往往較短。根據(jù)DNA 損傷修復(fù)缺陷的基因不同，XP 可分為八個基因型，分別為互補組 XPA、XPB、XPC、XPD、XPE、XPF、XPG，以及一個變異型 XPV[3]。其中，XPD 致病基因為 ERCC2，該類型在我國十分罕見，目前國內(nèi)僅有3 例報道。本研究結(jié)合我院診斷的1 個XP家系并復(fù)習(xí)相關(guān)文獻，探討ERCC2 基因?qū)е轮善げ?XPD)的臨床特征，進一步加深臨床醫(yī)生對該疾病的認識。

1 對象與方法

1.1 研究對象

患者，男，6 歲，因全身皮膚色素異常并漸加重5 年6 個月，乏力半月入院，初步診斷“著色性干皮病”。患者自半歲起，面部皮膚出現(xiàn)粟粒至花生米大小的黑褐色色素沉積，部分融合成片，漸延及軀干、四肢等部位，并逐漸增多。體格檢查：神清，皮膚色澤暗黃，散在點狀色素沉積，部分成片，雙下肢可見散在點狀出血點，左側(cè)頸部可觸及數(shù)枚黃豆大小腫大淋巴結(jié)，無壓痛；心肺聽診及腹部觸診未見異常；語言、運動、智力發(fā)育均落后同齡人；神經(jīng)病理征陰性。實驗室檢查：WBC 10.51*109/L，HGB 72g/L，PLT 98*109/L；炎癥指標高，肝腎功能、心肌酶譜、大小便常規(guī)基本正常；肺部CT 示雙肺異常密度影，右側(cè)肺門多處鈣化灶，懷疑結(jié)核。患兒淋巴結(jié)穿刺液涂片示熒光染色抗酸桿菌陽性，肺結(jié)核診斷明確，予以抗肺結(jié)核藥物治療+頸部淋巴結(jié)病灶清除術(shù)。患兒為第2 胎、順產(chǎn)，自幼體弱，易反復(fù)呼吸道感染，生長發(fā)育及智力均落后于正常同齡兒。父母表型正常，患者2 為患者1 的姐姐，12 歲，出生后2 月出現(xiàn)面部黑褐色色素沉著斑，皮膚色素沉著程度更嚴重。患者父母非近親結(jié)婚；患者的外祖父、外祖母近親結(jié)婚，表型均正常。

1.2 高通量測序檢測致病基因

經(jīng)家屬知情同意后取患者、患者姐姐及其父母外周血各2mL，采用外周血基因組DNA 提取試劑盒(Omega 公司)提取患者DNA，并測定DNA 的濃度。采用Illumina 公司Truseq Exome Library 建庫試劑盒以及IDT The xGen Exome Research Panel v1.0 全外顯子捕獲芯片對患者的DNA 進行文庫構(gòu)建，并利用Illumina 高通量測序儀Hisseq2000 進行全外顯子組測序。原始數(shù)據(jù)去除低質(zhì)量的讀長，比對到hg19 參考基因組的reads 經(jīng)過組裝拼接后，采用GATK 以及VarScan 軟件進行突變、SNPIndel 的識別、注釋并利用SIFT、Polyphen-2 以及Mutation Taster 等生物信息學(xué)軟件評定突變位點的生物學(xué)影響。結(jié)合臨床表型利Clinvar、HGMD、pubmed 等數(shù)據(jù)庫對給出的突變數(shù)據(jù)進行再次分析，確定致病位點。利用NCBI 數(shù)據(jù)庫檢索突變位點上下游序列并設(shè)計引物，利用PCR 技術(shù)擴增含有突變位點的片段序列并進行sanger 測序(3500DX 測序儀)驗證患者及家屬。

1.3 生物信息學(xué)分析

對檢測出的ERCC2 基因突變利用Mutation Taster、Polyphen2等在線軟件預(yù)測變異的致病性，利用生物信息學(xué)在線軟件進行不同物種間EHMT1 蛋白序列的保守性分析，利用ACMG 指南評估突變的臨床意義。

2 結(jié)果

經(jīng)過全外顯子測序以及Sanger 一代測序驗證后發(fā)現(xiàn)，患者1 的ERCC2 基因(NM_000400)存在c.1847 G＞A 以及c.1988 G＞A 復(fù)合雜合突變，采用同樣的方法患者2 也檢測到上述兩種突變。c.1847 G＞A 與c.1988 G＞A 這兩個雜合突變分別來源于患者父親、母親。

c.1847 G＞A 突變遺傳來自患者父親，該突變導(dǎo)致ERCC2基因編碼的蛋白第616 位氨基酸由精氨酸突變?yōu)楣劝滨０?p.R616Q)，根據(jù)ACMG 指南該位點為致病性改變(PS1 與已知的致病變異相同；PM2 文獻數(shù)據(jù)庫記錄的低頻變異；PP1：支持家系共分離，PP3 多種生信軟件預(yù)測突變對蛋白功能有影響)。

c.1988 G＞A 突變來自患者母親，該突變導(dǎo)致ERCC2 基因編碼的蛋白第663 位氨基酸由半胱氨酸突變?yōu)榻j(luò)氨酸(p.C663Y)，依據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(ACMG)指南[4]為可能致病性改變(PM2 低頻變異；PM5：變異位于之前報道過的氨基酸殘基；PP1：支持家系共分離，PP3 多種生信軟件預(yù)測突變對蛋白功能有影響)，該位點未見報道，氨基酸保守性分析發(fā)現(xiàn)該位點在不同的物種間保守，提示該位點異常可能影響蛋白的功能或穩(wěn)定。

圖1 兩例患者及其父母ERCC2 測序結(jié)果分析

圖2 突變位點663 位氨基酸(半胱氨酸)在不同物種間的保守性分析

3 討論

本研究中的家系患者均在半歲以內(nèi)發(fā)病，患者1 步態(tài)不穩(wěn)，合并肺結(jié)核感染可能與母親曾感染肺結(jié)核有關(guān)；患者2 皮膚色素沉著更嚴重，可能與防曬護理較晚有關(guān)。經(jīng)過全外顯子測序后發(fā)現(xiàn)，該家系成員的ERCC2 基因(NM_000400)存在c.1847 G＞A(p.R616Q) 與c.1988 G＞A(p.C663Y) 復(fù) 合 雜 合 突 變，其 中c.1988 G＞A(p.C663Y)為新發(fā)突變。

ERCC2 基因位于19 號染色體19q13.32 區(qū)域，基因全長21Kb，編碼87kD 大小的蛋白，ERCC2 作為DNA 修復(fù)基因，是ATP 依賴性的轉(zhuǎn)錄因子II(TFIIH)復(fù)合物的一部分，可通過5"-3"解旋酶活性分離雙螺旋結(jié)構(gòu)[5-7]。研究表明TFIIH 復(fù)合物參與核苷酸切除修復(fù)途徑(NER)，該途徑可以修復(fù)由化學(xué)治療和基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄引起的DNA 損傷。ERCC2 基因在外源性基因逆轉(zhuǎn)錄過程中和內(nèi)源性基因的逆轉(zhuǎn)錄過程中均發(fā)揮抑制作用，因此它不僅參與DNA 損傷修復(fù)也可能在防御逆轉(zhuǎn)錄病毒感染中發(fā)揮作用[8]。有實驗研究證實，ERCC2 基因缺陷的細胞更容易感染人類免疫缺陷病毒及Moloney 小鼠白血病病毒[9]。雖然ERCC2抑制逆轉(zhuǎn)錄的機制尚不清楚，但是ERCC2 保護基因在防止了不良DNA 片段插入方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，使得基因組保持完整性[10]。

目前文獻及數(shù)據(jù)庫中收錄了 100 多種與疾病相關(guān)的ERCC2 基因突變，其基因型與表型關(guān)系復(fù)雜；不同類型或者不同位點的突變導(dǎo)致的臨床表型及嚴重程度差異很大，如患者可表現(xiàn)為XPD、XPD 合并 Cockayne 綜合征、毛發(fā)硫營養(yǎng)障礙以及腦-眼-面-骨骼綜合征、膀胱移形細胞腫瘤等[11]。當ERCC2基因突變表現(xiàn)為XPD 時，該基因突變位點通常發(fā)在在Rad51 功能域或是RecA-like 功能域，這2 個區(qū)域分別又稱HD1、HD2，主要負責調(diào)節(jié)其解旋酶活性[12,13]。本案例中，患者1 和患者2的ERCC2 基因突變位點均在HD2。

XP 亞型在不同的國家和地區(qū)具有顯著的分布差異，其中我國患者主要是XPA、 XP-C、XP-G、XP-V 這4 種類型，XP-A最為常見，而XP-D 極為罕見[14]。XPD 患者一般起病較早，皮膚色素沉著明顯，腫瘤發(fā)生率高。部分患者并發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)損害，如步態(tài)不穩(wěn)、肌張力低下、肌痙攣等[15]。雖然該家系患者尚未并發(fā)皮膚腫瘤和神經(jīng)系統(tǒng)損害，但應(yīng)嚴格避光，定期復(fù)查。

綜上所述，本研究報道了國內(nèi)罕見的1 個著色性干皮病D型家系，發(fā)現(xiàn)了ERCC2 基因一個未見報道的新突變，豐富了人類遺傳性疾病的基因突變數(shù)據(jù)庫。在臨床工作中，病史資料結(jié)合基因檢測，有助于本類疾病的早診斷與精確分型，為患者及家屬提供治療管理和遺傳生育方面的建議。