發酵全混合飼料在綿羊體外瘤胃發酵中對纖維降解率、纖維降解菌數量及發酵特性的影響

■王 超 薛樹媛 李九月 韓紅燕

(1.內蒙古自治區農牧業科學院，內蒙古呼和浩特010031；2.內蒙古大學省部共建草原家畜生殖調控與繁育國家重點實驗室，內蒙古呼和浩特010031)

全混合飼料（total mixed ration，TMR）是根據反芻動物不同生理階段的營養需要量以及飼養目的，按照營養調控技術把青貯、干草等粗飼料切成一定長度，再添加一定比例的精料、各種礦物質、維生素等充分攪拌、混合而加工成的一種營養相對平衡的日糧[1]。TMR飼喂技術始于20世紀60年代，最先在美國、英國和以色列等國家使用，20世紀80年代，在韓國和日本被廣泛使用。TMR把粗飼料和精飼料混合后再飼喂，可以有效避免家畜的選擇性采食，改善一些原料的適口性；相同的飼料配比，可以維持瘤胃發酵和乳成分的穩定性；TMR 飼料可以提高干物質采食量，促使家畜均衡采食，有效減少瘤胃疾病的發生[2]。TMR 的使用促進了集約化養殖場的進程，是養殖業的一次變革。但是，由于TMR含有較多的可溶性糖分，且為了保證TMR的采食效果，一般在TMR中添加40%～50%的水分，因此，在溫度炎熱的夏秋季節，非常容易發生腐敗變質，產生有毒有害物質，對家畜的健康以及畜產品的安全產生潛在性危險。古本史[3]研究表明，TMR飼料在夏季混合后放置12 h就開始發熱，24 h后溫度可達到50 ℃，TMR 的發熱和變敗導致飼料營養成分損失、適口性變差、家畜采食量下降等問題發生。Nishno等[4]、Wang等[5]研究表明：TMR經過發酵處理加工成發酵全混合飼料（fermented total mixed ration，簡稱FTMR）后，擁有比TMR更長的保存期，在開封后不易發生有氧變敗，還可以改善飼料的適口性，而且，TMR在發酵過程中一些營養成分發生改變，可以提高飼料的利用率。周振峰等[6]研究表明：飼喂FTMR可以顯著增加奶牛干物質采食量，提高產奶量（7.69%）和標準乳產量（5.20%），并且提高粗脂肪和粗蛋白表觀消化率。李林等[7]研究顯示，飼喂玉米秸稈生物發酵飼料，平均日增重和粗纖維消化率極顯著高于玉米秸稈組，干物質消化率顯著高于玉米秸稈組。Cao 等[8]試驗顯示，FTMR 在體外瘤胃培養中可以提高纖維的降解率。張俊瑜[9]研究表明：FTMR飼料可以提高營養物質瘤胃消失率和有效降解率，而且可以顯著提高產奶量、標準乳產量、飼料效率和乳糖含量。在邱玉朗等[10]用FTMR飼喂肉羊的試驗中，FTMR組肉羊的平均日增重與料重比優于TMR組，FTMR組的粗纖維消化率顯著高于TMR組。FTMR飼料在家畜飼養中發揮著重要的作用，關于FTMR在瘤胃內降解情況，對瘤胃發酵，瘤胃纖維降解菌數量變化等影響的研究不多，本研究旨在進一步說明FTMR在體外培養中對干物質和纖維降解率、瘤胃纖維降解菌數量以及瘤胃發酵特性的影響。

1 材料和方法

1.1 TMR和FTMR

全混合飼糧（TMR）的粗料（意大利黑麥草青貯22%、甜高粱青貯8%、全株玉米青貯7%、甜菜渣顆粒8%）精料比為46∶54。試驗用TMR 為置于-20 ℃冰箱中保存的上述TMR；試驗用FTMR為塑料袋密封發酵的上述TMR（25～30 ℃環境中貯存30 d）。將TMR和FTMR 樣品60 ℃烘干48 h 后粉碎過1.0 mm 篩子，稱取1.0 g 加入到120 mL 的小口玻璃培養瓶中，作為體外培養的發酵底物。

1.2 體外培養

按照Mcdougal[11]的方法配制人工唾液，培養前持續通入CO2，直到人工唾液變為粉色。選取裝有永久瘤胃瘺管的健康綿羊3 只，每日飼喂2 次（08：00 和19：00），早上飼喂之前采取瘤胃液，用4層紗布過濾后與人工唾液按照1∶2配制成人工瘤胃液，在39 ℃水浴鍋中邊通入N2邊量取50 mL加入裝有TMR和FTMR底物的小口培養瓶中，用鋁蓋封口后置于39 ℃恒溫振蕩水浴箱中培養。記錄6 h和24 h產氣量，測定培養液pH和揮發性脂肪酸的含量、發酵殘渣的干物質(DM)和中性洗滌纖維(NDF)降解率，以及纖維降解菌數量。TMR和FTMR樣品設置6次重復。并利用人工瘤胃液設置3個空白平行樣品（用于干物質降解率測定）。

1.3 測定內容

①產氣量：利用100 mL 注射器每隔2 h 測量一次樣品和空白平行樣中氣體生成量，記錄并將氣體抽出，培養結束后樣品中產生氣體之和減去空白平行樣中產生氣體之和即為培養生成氣體量。

②pH值和揮發性脂肪酸的含量：培養液的pH值用pH 計（PB-10Sartorius）測定。將培養樣品和空白樣品在4 ℃以4 000 r/min 離心15 min，上清液用5%偏磷酸除去蛋白質，用0.22 μL的濾膜過濾，利用高效液相色譜儀（Agilentl 260，色譜柱為：Shodex Rspak KC-811 S-DVB gel Column 30 mm×8 mm，檢測器：SPDM10AVP，流動相：3 mmol/L高氯酸，流速：0.6 mL/min；柱溫50 ℃，檢測波長210 nm，進樣量5 μL）測定揮發性脂肪酸含量。

③干物質和中性洗滌纖維體外降解率：將②中3個培養管以及空白管中離心所得沉淀物分別用純化水洗滌3 次后，移入坩堝中60 ℃烘干48 h，稱取殘渣重量，計算出干物質體外消化率。NDF 含量采用ANKOM A200纖維分析儀測定。

干物質體外降解率計算公式：

DMD（%）=100×（A-B+C）/A

式中：DMD——干物質降解率(%)；

A——待測物降解前干物質質量(g)；

B——待測物降解后干物質質量(g)；

C——空白中沉淀物干物質質量(g)。

中性洗滌纖維體外降解率公式：

DNDF(%)=100×（A×N1-B×N2+C×N3）/C×N1

式中：DNDF——中性洗滌纖維降解率(%)；

A——待測物降解前干物質質量(g)；

N1——待測物降解前干物質中中性洗滌纖維含量(%)；

B——待測物降解后干物質質量(g)；

N2——待測物降解后干物質中中性洗滌纖維含量(%)；

C——空白中沉淀物干物質質量(g)；

N3——空白沉淀物干物質中中性洗滌纖維含量(%)。

④纖維降解菌數量測定：將②中另外3個培養管離心所得沉淀物收集放入50 mL離心管中于-20 ℃冰箱保存，取200 mg冷凍沉淀物，根據試劑盒[天根生化（北京）科技有限公司]說明書提取細菌總DNA，利用熒光定量實時PCR（Real-time PCR）對三種主要纖維降解菌：產琥珀酸擬桿菌（Fibrobacter succinogenes）、黃色瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）和白色瘤胃球菌（Ruminococcus albus）進行定量分析，三種纖維降解菌引物設計如下[12]：

F. succinogenes 引物F: GGTATGGGATGAGCTT?GC與R: GCCTGCCCCTGAACTATC；

R. flavefaciens 引物F: ATTGTCCCAGTTCAGATT?GC與R:GGCGTCCTCATTGCTGTTAG；

R. albus 引 物F: TCTGTCTTTGGGGACGATAA 與R: AAGTGCAGTTCAGGGTTAA。

1.4 數據處理

采用SPSS 17.0統計軟件對數據進行獨立樣本的T 檢驗，以P＜0.05 為差異顯著，文中數據均以“平均數±標準差”表示。

2 結果與分析

TMR和FTMR營養成分和pH如表1所示，除可溶性碳水化合物含量和pH值差異較大外，干物質、有機物、粗蛋白質、中性洗滌纖維和非纖維性碳水化合物含量均相近。

表1 TMR與FTMR中營養成分含量以及pH值（風干基礎）

培養6 h后，FTMR組氣體生成量極顯著低于TMR組（P＜0.01）；乙酸、丙酸以及總的揮發性脂肪酸含量均顯著高于TMR組（P＜0.05）；兩組的干物質和中性洗滌纖維降解率及培養液pH均無顯著差異。培養24 h后，FTMR 組干物質和中性洗滌纖維降解率極顯著高于TMR組（P＜0.01）；pH值顯著低于TMR組（P＜0.05）；乙酸含量極顯著高于TMR組（P＜0.01），丙酸和總揮發性脂肪酸含量顯著高于TMR組培養液中含量（P＜0.05）。但兩組氣體生成量無顯著差異（P＞0.05），見表2。

培養6 h 后，FTMR 組未降解培養底物中F. suc?cinogenes 和R. albus 的16S rDNA 拷貝數比TMR 組有升高趨勢，但差異不顯著（P＞0.05）；TMR 組和FTMR組中未檢出R. flavefaciens。培養24 h 后，FTMR 組未降解培養底物中F. succinogenes 的16S rDNA 拷貝數比TMR 組有升高趨勢，差異不顯著（P＞0.05）；FTMR組未降解培養底物中R. albus數量和R. flavefaciens極顯著高于TMR組（P＜0.01），見表3。

3 討論

由于在青貯發酵過程中，可溶性碳水化合物(WSC)被乳酸菌所利用，分解成揮發性脂肪酸和乳酸等，使pH 值降低，抑制其他雜菌的繁殖，從而實現飼草料的長期保存。因此，FTMR 中WSC 含量和pH 值都低于TMR，這符合青貯飼料發酵的規律。飼料產氣量的大小反映了飼料可消化性的大小，與飼料中有機物的降解程度呈正比[13]。產氣量和體外干物質降解率越高，飼料利用率越高[14]。體外干物質降解率（IVDMD）的大小反映了飼料消化的難易程度。體外發酵產氣的底物主要是碳水化合物，產氣量的多少與瘤胃微生物對底物的利用程度、微生物的活力以及飼料營養價值的高低都相關。Menke 等[15]研究表明：飼料中有機物的消化率和體外培養的產氣量之間存在高度的相關性，即產氣量越高，飼料在瘤胃內的發酵程度越高。程鵬輝等[16]研究表明飼草品質越好，產氣量越大。本試驗中，培養6 h，TMR的產氣量極顯著高于FTMR 的產氣量（P＜0.01），隨著培養時間到24 h后，FTMR組的產氣量高于TMR組，但差異不顯著，因為TMR 中WSC 含量高于FTRM 組，體外培養的前期以WSC的降解為主，產生氣體也多，體外培養后期以結構性碳水化合物降解較多，氣體生成量也較多。本試驗結果與Hatew等[17]、Wang等[18]研究結果一致：當飼糧中富含容易發酵的非結構性碳水化合物時，會有助于其被微生物降解，產生更多的氣體。培養24 h 后，FTMR 組的干物質降解率和中性洗滌纖維降解率極顯著高于TMR 組，顯示出干物質降解率與產氣量之間的正相關性。這個結果可能提示TMR經過發酵處理后，可以改善飼料品質，使其在瘤胃中利于降解、有助于提高瘤胃消化率，從而提高飼料消化利用率。

表2 TMR和FTMR在體外瘤胃發酵中氣體生成量、干物質和中性洗滌纖維降解率以及揮發性脂肪酸含量

表3 體外瘤胃發酵中不同時間點的TMR和FTMR中纖維降解菌16S rDNA基因拷貝數

瘤胃液pH值可以作為評價瘤胃發酵水平的綜合指標，綜合反映瘤胃微生物、代謝產物、有機酸產生、吸收、排除及中和狀況，主要受唾液、日糧性質、處理方法以及其降解物堿化和緩沖的影響[19]。有研究表明：瘤胃pH值低于6.4，瘤胃微生物活性會受到影響，從而影響瘤胃發酵[20]。盧德勛[21]認為促進纖維素消化的適宜瘤胃液pH 值范圍為6.0～6.8，pH 值過低時，纖維分解菌生長就會受到抑制。本試驗中，培養24 h后，FTMR 的培養液pH 值顯著低于TMR 組(P＜0.05)，但二者都處于瘤胃液pH 值的正常范圍，認為對瘤胃微生物活力、數量影響比較小。

揮發性脂肪酸（volatile fatty acids，VFA），包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸和異戊酸等[22]，是由飼料中碳水化合物降解產生，為反芻動物提供能量，有研究表明反芻動物總能量的70%～80%由VFA 提供[23]。李德勇等[24]研究表明：飼料的消化率越高，其揮發性脂肪酸的產量越高，這與本試驗結果一致。李旺[25]研究表明，VFA 的生成受飼料日糧組成、飼料加工處理、瘤胃微生物、瘤胃pH值以及飼喂方式的影響。飼料加工處理手段包括粉碎、切斷、氨化、堿化、微生物及酶的預處理。這些方法可以提高反芻動物的采食量，擴大飼料與瘤胃液的接觸面積，使瘤胃內被發酵的原料和發酵機會增加，提高VFA的產量。本試驗中培養6 h和24 h后，FTMR組中總揮發性脂肪酸的生成量均顯著高于TMR組(P＜0.05)，顯示出FTMR組瘤胃體外培養中消化率高于TMR組。可能就是因為TMR在發酵過程中，改變了飼料中結構性碳水化合物的結合方式，擴大了飼料與瘤胃液的接觸面積，提高了瘤胃內消化率，從而提高了總揮發性脂肪酸生成量。

乙酸是反芻動物脂肪合成的主要前體物質，是乳腺合成乳脂中脂肪酸的重要原料[22]；丙酸可以異生成葡萄糖，保障家畜的生產性能和泌乳性能。本試驗中，培養6 h和24 h，FTMR 組培養液中乙酸和丙酸含量都顯著高于TMR 組(P＜0.05)，說明FTMR 在瘤胃發酵中可以產生較多的乙酸和丙酸，示意FTMR飼料可能利于保障家畜的生產性能和泌乳性能。

瘤胃內優勢纖維降解菌主要包括產琥珀酸擬桿菌（Fibrobacter succinogenes），黃色瘤胃球菌（Rumino?coccus flavefaciens）和白色瘤胃球菌（Ruminococcus al?bas）[26]。本試驗中，培養6 h后，FTMR處理組中F. suc?cinogenes和R. albus的16S rDNA拷貝數比TMR處理組呈升高趨勢，差異不顯著；培養24 h，FTMR處理組中R.albus和R. flavefaciens的16S rDNA拷貝數比TMR處理組極顯著升高(P＜0.01)，F.succinogenes也表現為增高趨勢，并且FTMR在瘤胃發酵中可以產生較多的乙酸和丙酸。這可能是因為TMR中可溶性糖分子含量比FTMR中高，瘤胃中的NFC分解菌與纖維分解菌競爭可利用氮進而抑制了后者的生長，表現為TMR中纖維降解菌數量低于FTMR。這與Heldt等[27]、Khalili等[28]的研究結果一致：日糧中添加蔗糖降低了纖維的降解速率和程度。本試驗結果顯示：FTMR在瘤胃中可促進纖維降解菌數量的提升，從而提高了纖維降解率。

4 結論

經過體外發酵表明，發酵TMR（FTMR）可以提高干物質和中性洗滌纖維降解率，促進發酵，提高了纖維降解菌數量。