西農薩能奶山羊瘤胃產蛋白酶酵母菌的篩選研究

■魏滿紅 張佳運 陳玉林 楊雨鑫

（西北農林科技大學動物科技學院，陜西楊凌712100）

幼齡動物的消化器官未發育完全，其所分泌的蛋白酶不能將飼料中的蛋白質完全消化，將蛋白酶添加在飼料中可以促進幼齡動物對蛋白質消化吸收，同時蛋白酶也可以促進飼料中抗營養因子的降解，提高動物機體的免疫力。與瘤胃微生物相比，添加外源菌可能會與瘤胃微生物產生拮抗等不良反應。從瘤胃中篩選出的產蛋白酶菌更易于在瘤胃中定植[1]。在飼料行業內根據“最適作用pH 值”為標準，將蛋白酶分為酸性蛋白酶、中性蛋白酶以及堿性蛋白酶[2]。堿性蛋白酶的最適作用pH 值為9～11，最先在豬的胰腺中發現，主要在小腸中發揮作用，堿性環境下可以把蛋白質水解成小分子肽鏈[3]；從酶的活力pH值曲線分析可知，酸性蛋白酶的最適作用pH 值為2～4，能夠水解蛋白質肽鍵，酸性蛋白酶的活性部位中含有一個或更多的羧基；中性蛋白酶是一種可用于蛋白質水解的內切酶，目前也已在飼料行業中廣泛應用[4]。利用微生物生產蛋白酶具有成本低、產出率高、周期短、易控制等優點，為當下規模化生產蛋白酶主要來源[5]。產蛋白酶微生物主要有乳酸桿菌和芽孢桿菌，但產酶菌種較為單一，難以滿足工業化對各類蛋白酶的生產需求。有研究表明，酵母菌具有高生產率、發酵快[6]等優勢，但是關于酵母菌產蛋白酶報道較少。本試驗對山羊瘤胃內容物中產蛋白酶酵母菌進行初步分離和鑒定，并對其酶學特性進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 樣品的來源、培養基、試劑

1.1.1 樣品的來源

從西北農林科技大學畜牧站內抽取西農薩能奶山羊瘤胃液，立即裝入無菌管，帶回實驗室保存在-80 ℃冰箱中。

1.1.2 培養基

蛋白酶培養基：葡萄糖50 g、蛋白胨10 g、KH2PO42 g、MgSO4·7H2O 0.4 g、用無菌水定容至1 000 mL，pH值調至7，121 ℃滅菌15 min。

植酸酶培養基：氯化鉀0.5 g、植酸鈉2 g、硫酸錳0.03 g、葡萄糖30 g、硫酸鎂0.5 g、硫酸亞鐵0.03 g、硝酸銨5 g，用無菌水定容至1 000 mL，pH 值調至5.5，121 ℃滅菌15 min。

纖維酶培養基：羧甲基纖維素鈉10 g、蛋白胨2 g、酵母膏0.5 g、K2HPO41.5 g、Na2SO42.5 g、瓊脂20 g，用無菌水定容至1 000 mL，pH 值調至7.0，121 ℃滅菌15 min。

果膠酶培養基：果膠10 g、酵母提取物10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，用無菌水定容至1 000 mL，pH值調至7.0，121 ℃滅菌15 min。

YPD 培養基：葡萄糖20 g、酵母粉5 g、蛋白胨10 g，用無菌水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌15 min。

1.1.3 試劑

羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、3，5-二硝基水楊酸、葡萄糖、植酸鈉、果膠、牛肉膏、檸檬酸三銨、乙酸鈉、蔗糖、瓊脂、酪蛋白、干酪素、酪氨酸、三氯乙酸、脫脂乳奶粉、HCl、PDA、KH2PO4、KCl、MgSO4、FeSO4、MnSO4、吐溫80、NaCl、NaOH、H2SO4、Na2CO3、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O，購自楊凌曉白化玻儀器公司；酵母提取物、蛋白胨，購自OXOID 公司；Folin-酚，購自北京東方順科生物科技有限公司；2×Taq PCR Master?Mix，TIANampYeast DNA kit（離心柱型），gelRed 核染色劑，引物NL-1（5-GCATATCAATAA GCGGA GGA AAAG-3），NL-4（5-GGTCCGT GTTTCAAGACG-3）購自北京擎科生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 產蛋白酶酵母菌株的篩選

將瘤胃液10 倍梯度稀釋于滅菌水中，在搖床上振蕩培養30 min。取20 μL 稀釋液涂布于PDA 固體培養基，37 ℃恒溫培養24 h，挑取符合酵母菌菌落形態的菌株進行純化。將純化得到的酵母菌株，接種在脫脂乳培養基中進行初篩，置于30 ℃恒溫培養箱中培養5 d[7]，篩選出水解圈較大的菌株進行活化擴繁，將菌株培養液以1∶1 與30%甘油混合保存于2 mL EP管中，放置-80 ℃冰箱內進行保存。

1.2.2 菌株的分子生物學鑒定

將2 mL左右的種子液加入離心管中，10 000 r/min離心2 min，棄上清液富集菌體，使用酵母菌基因組DNA 提取試劑盒提取目標菌株基因組DNA。以基因組DNA 為模板，用酵母菌通用引物NL-1 和NL-4 對26S rDNA D1/D2 區基因片段進行PCR 擴增。擴增條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸45 s，共35 個循環；最后72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳確認擴增效果和片段大小。測序結果應用NCBI Blast 在線比對工具對測序結果進行同源性比對。

1.3 產蛋白酶酵母菌產酶條件優化

將篩選出來的菌株從-80 ℃冰箱拿出，立即放置到冰盒中進行冰浴融化，再接種到液體發酵培養基中，于不同溫度、不同pH值、不同接種量濃度、100 r/min條件下搖床培養，采用福林法[8]測定粗酶液中蛋白酶活力。

1.3.1 培養時間對菌株產蛋白酶影響

將初始菌液按體積分數3%接種量，在30 ℃、pH為7、100 r/min 條件下搖床培養，每隔12 h 取樣，5 000 r/min條件下離心10 min，取上清液測蛋白酶活力，繪制酶活統計圖，確定最適產酶時間。

1.3.2 接種量對菌株產蛋白酶的影響

將初始菌液按體積分數1%、2%、3%、4%、5%接種量在30 ℃、pH 值為7、100 r/min 條件下搖床培養，培養時間為1.3.1 得到的各菌株最佳產酶時間，5 000 r/min 離心10 min，取上清液測蛋白酶活力，繪制酶活統計圖，確定最適接種量。

1.3.3 培養溫度對菌株產蛋白酶的影響

將初始菌液按1.3.2得到的各菌株最佳接種量，在溫度分別為18、25、30、37、50 ℃、pH 值為7、100 r/min條件下搖床培養，培養時間為1.3.1 得到的各菌株最佳產酶時間，5 000 r/min 離心10 min，取上清液測蛋白酶活力，繪制酶活統計圖，確定最適培養溫度。

1.3.4 初始培養基pH值對菌株產蛋白酶的影響

將培養基的初始pH 值分別調節為5、6、7、8、9、10，各菌株按1.3.2 最佳接種量及1.3.3 最佳溫度、100 r/min 條件下搖床培養，培養時間為1.3.1 各菌株最佳產酶時間，5 000 r/min 離心10 min，取上清液測蛋白酶活力，繪制酶活統計圖，確定最適產酶pH值。

1.4 產植酸酶、果膠酶、纖維素酶三種水解酶效果的研究

將初始菌液按體積分數3%接種量接入產纖維素酶培養基、產果膠酶培養基、產植酸酶培養基，30 ℃培養48 h 后，5 000 r/min 離心10 min，分別取上清液采用DNS 法測定纖維素酶活力、果膠酶活力、植酸酶活力，繪制酶活統計圖。

2 結果

2.1 產蛋白酶酵母菌株的篩選結果

通過比對《酵母菌的特征與鑒定手冊》與平板上的菌株外觀形態，結合相關試驗分析進行初篩，篩選出Y1、Y5、Y12、Y16、Y19、Y20、Y21、Y22、Y27、Y28、Y29、Y30等12株酵母菌。將這12株菌點涂到脫脂乳培養基上30 ℃恒溫培養5 d，Y1、Y5、Y16、Y20、Y21五株菌均出現明顯的水解圈（見圖1）。

圖1 具有明顯水解圈菌落

2.2 分子生物學鑒定

將分離出的五株酵母菌基因組進行26S rDNA區PCR 擴增，用1%的瓊脂糖凝膠對擴增結果檢測，電泳順序為2 000 bp Marker、Y1、Y5、Y16、Y20、Y21，擴增后的結果如圖2所示。

圖2 菌株26S rDNA PCR擴增產物電泳圖

5 株菌擴增出的片段長度均在500～750 bp，條帶清晰可見，無雜帶，可用于菌株26S rDNA 測序。將PCR 產物送北京擎科生物科技有限公司武漢分公司測序，利用QuickStart 軟件對測序結果進行拼接后通過NCBI Blast 在線比對工具對測序結果進行同源性比對。Y1為庫德畢赤酵母、Y5為東方伊薩酵母、Y16為馬克斯克魯維酵母、Y20為近平滑假絲酵母、Y21為單孢釀酒酵母。

2.3 產蛋白酶酵母菌產酶條件優化結果

2.3.1 培養時間對菌株產蛋白酶的影響

3%接種量在培養基pH 值為7、30 ℃、100 r/min條件下搖床培養，培養時間對菌種產蛋白酶的影響如圖3所示。隨著時間的增加，培養液中菌株產蛋白酶活力也逐漸增加，在48 h 時產蛋白酶活力達到了最高；培養超過48 h 后，蛋白酶活力逐漸減少。因此篩選出的產蛋白酶酵母菌株的最適產酶時間為48 h。

圖3 培養時間對菌株產蛋白酶的影響

2.3.2 菌液接種量對菌株產蛋白酶的影響

將初始菌液按體積分數1%、2%、3%、4%、5%的接種量，在培養基pH 值為7、30 ℃、100 r/min 條件下搖床培養48 h，測定蛋白酶活力，不同接種量對菌株產蛋白酶的影響如圖4 所示。在接種量1%時，產蛋白酶活力較低；隨著初始菌液接種量增加，產蛋白酶活力逐漸上升，其中菌株庫德畢赤酵母Y1、馬克斯克魯維酵母Y16在3%時酶活最大，東方伊薩酵母Y5、近平滑假絲酵母Y20、單孢釀酒酵母Y21在4%時酶活最大。

圖4 接種量對菌株產蛋白酶的影響

2.3.3 培養溫度對菌株產蛋白酶的影響

各菌株按2.3.2得到的最佳接種量、培養基pH為7、100 r/min條件下搖床培養48 h，不同培養溫度對菌株產蛋白酶的影響如圖5 所示。菌株庫德畢赤酵母Y1、單孢釀酒酵母Y21產蛋白酶的最佳溫度為30 ℃，菌株東方伊薩酵母Y5、馬克斯克魯維酵母Y16、近平滑假絲酵母Y20產蛋白酶的最佳溫度為37 ℃。

圖5 培養溫度對菌株產蛋白酶的影響

2.3.4 初始培養基pH對菌株產蛋白酶的影響

各菌株按2.3.2 得到的最佳接種量，2.3.3 得到的最培養溫度、100 r/min、不同培養基pH 值(5、6、7、8、9、10)條件下搖床培養48 h，不同培養基pH值對菌種產蛋白酶的影響如圖6 所示。隨著pH 值的升高，各培養液中蛋白酶的活性也逐漸升高，在pH值為9時5株菌的培養液中蛋白酶的活性均最高。

圖6 初始培養基pH對菌株產蛋白酶的影響

2.4 產植酸酶、果膠酶、纖維素酶三種水解酶效果的研究

2.4.1 產植酸酶效果的研究

圖7 產植酸酶效果的研究

由圖7可知，各菌株以3%的添加量，100 r/min條件下搖床培養48 h后，庫德畢赤酵母Y1、馬克斯克魯維酵母Y16、單孢釀酒酵母Y21具有較高的植酸酶活性，酶活力分別達到14.38 U/mL、15.34 U/mL、15.63 U/mL。東方伊薩酵母Y5和近平滑假絲酵母Y20產生的植酸酶較少，低于1.00 U/mL。

2.4.2 產果膠酶效果的研究

由圖8可知，各菌株以3%的添加量，100 r/min條件下搖床培養48 h后，五株菌株均表現出較高的果膠酶活性。其中單孢釀酒酵母Y21 酶活力顯著高于其他菌株（P＜0.05），達到15.18 U/mL。

2.4.3 產纖維素酶效果的研究

圖8 產果膠酶效果的研究

圖9 產纖維素酶效果的研究

由圖9 可知，各菌株以3%的添加量，100 r/min條件下搖床培養48 h 后，五株菌株均表現出較高的纖維素酶活性，均超過180 U/mL，其中近平滑假絲酵母Y20 酶活力顯著高于其他菌株（P＜0.05），達到199.08 U/mL。

3 討論

3.1 發酵條件對微生物蛋白酶活力的影響

隨著工業用酶用量的不斷增加，已有的蛋白酶無法滿足日益增長的需求。篩選出新的高產產酶菌株和對已有的菌株產酶條件進行優化以提高蛋白酶的產量和品質，是兩種最主要的解決方案[9]。從土壤、污泥、海水及動物腸道中已經分離出可產生中性、堿性或耐鹽性蛋白酶的微生物菌株，同時也從不同來源的植物中篩選出了產蛋白酶的內生真菌、細菌和放線菌[10]，極大地拓寬了產蛋白酶菌的菌株庫。菌株在液體培養基中發酵，其產酶能力也會受到培養基發酵條件的影響。溫度、pH 值、發酵的時間等條件會對菌株的生產繁殖產生影響，從而導致最終的蛋白酶活性不同[11]。

本研究通過點涂于脫脂乳平板來初篩具有降解蛋白酶的菌，喬傳麗等通過計算HE 值，比對HE 大小初步判斷產蛋白酶活力，但是實際上培養出來的菌落并不是完整的圓形，通過測量水解圈直徑、菌落直徑等數據，誤差較大，缺乏科學嚴謹性。據報道，HE值和蛋白酶活力的高低并非顯著的正相關[12]。因此結合相關實際狀況，通過肉眼觀察，找出水解圈相對而言比較明顯的五株菌，進行后續產蛋白酶條件優化的試驗。

將篩選出的菌株以3%接種量在培養基pH 為7、溫度30 ℃、100 r/min條件下培養，12 h時菌株還未開始增殖，數量較少，產蛋白酶能力有限，故產蛋白酶活力較低；隨著時間的增加，酵母菌數量增多，培養液中菌株產蛋白酶活力也逐漸增加，在48 h時產蛋白酶活力達到了最高；這與Zhou等[13]的研究結果一致。但隨著時間的延長，培養液中營養物質減少蛋白酶活力逐漸降低。劉靜等[14]發現產蛋白酶菌在30 h 蛋白酶活力達到最高。在接種量1%時，培養48 h 產蛋白酶活力較低，隨著初始菌液接種量增加，產蛋白酶活力逐漸上升，其中菌株庫德畢赤酵母Y1、東方伊薩酵母Y5、馬克斯克魯維酵母Y16在3%時酶活力最大，近平滑假絲酵母Y20、單孢釀酒酵母Y21在4%時酶活力最大。這同曹慧等[15]的研究結果一致，可能是當接種量較大時，菌體前期生長迅速，培養液中營養物質被迅速消耗，同時產生大量代謝廢物，抑制中后期菌體的生長。同時酵母菌在生長過程中會產生大量的乙醇，隨著乙醇含量的升高，培養液中pH值降低也會抑制菌株的增殖使蛋白酶的活性降低。將五株菌株加入到不同pH的培養液中，隨pH值的升高蛋白酶活也逐漸增加，五株菌均在pH值9的培養基中最高，達到200 U/mL以上，結合先前的報道可知，五株菌產生的均為堿性蛋白酶。在30～55 ℃蛋白酶的活性較高，篩選出的產蛋白酶酵母菌株庫德畢赤酵母Y1、單孢釀酒酵母Y21的最佳培養溫度為30 ℃，菌株東方伊薩酵母Y5、馬克斯克魯維酵母Y16、近平滑假絲酵母Y20 最佳培養溫度為37 ℃，溫度對產蛋白酶的活性也具有顯著的影響。

3.2 微生物產復合酶的研究

微生物由于繁殖速度快、發酵簡單、易于大規模生產等優點，目前成為蛋白酶、纖維素酶、植酸酶、果膠酶等生物酶類的重要來源。植酸鹽是谷類、豆類和油料中磷酸鹽和肌醇的主要儲存形式。磷以肌醇六磷酸的形式存在不能被人類、家禽或其他單胃動物利用。為了提高膳食植酸磷的利用率，不同來源的植酸酶一直是研究的熱點。Li 等[16]從魚類的腸道中分離出可以分泌大量植酸酶的海洋酵母菌株，該酵母的最佳產酶條件為pH5.0 和28 ℃。崔明玉[17]從酵子和全麥面團中篩選分離出具有較高植酸降解能力的一株異常威克漢遜姆酵母和一株釀酒酵母，其植酸酶活性分別為18.52 U/mL 和19.74 U/mL。本研究中篩選分離出的單孢釀酒酵母Y21植酸酶活性為15.63 U/mL，可能跟菌液的起始濃度等因素有關。

果膠酶屬于多糖家族，可以降解果膠物質。果膠酶在工業生產中占據領先地位，具有廣泛的應用前景，如植物纖維的脫膠、榨油，果汁和葡萄酒的澄清，生物燃料的生產，動物飼料的生產等。但像許多其他工業酶一樣，果膠酶在其經濟生產中也面臨著低產量和高生產率的限制[18]。據報道，果膠酶的50%來源是真菌和酵母菌，35%來源是細菌。近年來，已經篩選分離出了許多具有果膠酶活性的微生物，如可以生產果膠酶的黑曲霉菌和曼赫毛菌。此外，從土壤和牛糞便中篩選出的芽孢桿菌也能高效的生產果膠酶[19]。Karabi 等[20]從土壤中篩選出了產果膠酶的細菌在37 ℃和pH 7.5 的條件下產生最大的果膠酶活性0.671 U/mL。本研究中果膠酶活性達到15.18 U/mL，具有較高的果膠酶活性。果膠酶的活性高低可能和菌屬有關，本試驗篩選分離得到的菌株為酵母菌。

纖維素酶可以通過酶的協同作用將纖維素有效地水解為葡萄糖單位，將植物細胞中平常不消化以及難以消化的大分子物質，如大分子多糖、蛋白質和脂類等物質分解成小分子容易被動物吸收的物質。這些酶被稱為內切β-1-4-葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-D-葡萄糖苷酶[21]。有研究表明，幾乎所有酵母菌種均具有胞外纖維素酶活性，大多數酵母中纖維素酶活性在30 ℃時最高[22]。因此本研究對菌株在30 ℃產蛋白酶活性進行了探討，五株菌株均表現出較高的纖維素酶活性，均超過180 U/mL，其中近平滑假絲酵母Y20 酶活力顯著高于其他菌株（P＜0.05），達到199.08 U/mL。

具有產蛋白酶、果膠酶、植酸酶、纖維素酶的菌株對菜籽粕等進行發酵，不僅能夠為動物提供所需的營養物質，也是含有多種酶的復合酶制劑。復合的酶制劑具有互補作用，在多種酶的共同作用下，飼料中的一些抗營養因子會被破壞，可顯著促進動物生長，提高機體免疫力。據報道，將復合酶添加到不同動物的基礎日糧中，動物生產性能均顯著提高[23]。本文研究了從山羊瘤胃液中篩選出產蛋白酶的酵母菌并分析了影響產酶因素以及纖維素酶、植酸酶、果膠酶的活性，其結果將為雜粕類發酵飼料提供科學依據。

4 結論

①本試驗篩選出的5 株產蛋白酶菌經形態學分析及分子生物學（26S rDNA序列分析）鑒定菌株Y1為庫德畢赤酵母，Y5為東方伊薩酵母，Y16為馬克斯克魯維酵母，Y20為近平滑假絲酵母，Y21為單孢釀酒酵母。

②對各菌株產酶條件進行優化，在最佳產酶條件下，菌株庫德畢赤酵母Y1（時間48 h、接菌量3%、溫度30 ℃、pH 值9）酶活力為229.89 U/mL，東方伊薩酵母Y5（時間48 h、接菌量4%、溫度37 ℃、pH值9）酶活力為212.63 U/mL，馬克斯克魯維酵母Y16（時間48 h、接菌量3%、溫度37 ℃、pH值9）酶活力為208.44 U/mL，近平滑假絲酵母Y20（時間48 h、接菌量4%、溫度37 ℃、pH 值9）酶活力為211.74 U/mL，單孢釀酒酵母Y21（時間48 h、接菌量4%、溫度30 ℃、pH 值9）酶活力為209.96 U/mL。對復合酶進行測定，庫德畢赤酵母Y1、馬克斯克魯維酵母Y16、單孢釀酒酵母Y21 具有較高的植酸酶活性。五株菌株均表現出較高的果膠酶活性、纖維素酶活性。