右旋糖酐酶生產菌株的分離鑒定及發酵培養基優化*

楊 齊，黃斌良，吳華德，江朝明

(廣西多得樂生物科技有限公司，廣西南寧 530000)

0 引言

右旋糖酐是一種大分子聚合物，主要由D-葡萄糖分子通過α-1,6-糖苷鍵連接形成的主鏈，以及α-1,2-糖苷鍵和α-1,4-糖苷鍵形成的側鏈構成[1]。因其安全無毒、生物相容性好、來源豐富等特性，右旋糖酐已被廣泛應用在食品、醫藥等多個領域[2,3]。天然的右旋糖酐分子量相對較高，必須經酸水解或酶水解形成小分子量右旋糖酐后才能加以應用。但是酸法生產的右旋糖酐含有氯離子，并且所得產物分子量不統一，不能滿足臨床需求，而酶法反應條件溫和，所得產物分子量范圍比較狹窄，并且能大大減少污染[4]。

右旋糖酐酶(E.C.3.2.1.11)是一種誘導酶，能夠專一性水解右旋糖酐中的α-1,6-糖苷鍵[5,6]。生產右旋糖酐酶的微生物有很多，從一開始，真菌和細菌就被確定為能夠水解葡聚糖的主要酶源，特別是真菌。來源于細菌的右旋糖酐酶相對較少，并且其酶活力相對較低，但是卻具有良好的熱穩定性[7,8]。真菌來源的右旋糖酐酶大多穩定性好，酶活力較高，具有很高的研究價值和商業價值[9-13]。

Plackett-Burman (PB)實驗設計可以從大量變量中篩選主要因素，響應面法是一種有效的實驗工具，通過它可以確定多變量系統中的最優條件。因此，為了有利于工業化生產，本研究擬篩選能夠高產右旋糖酐酶的真菌菌株，并利用響應面法對其發酵生產右旋糖酐酶的培養基進行優化，以期得到最優的發酵培養基，為其深入研究及工業化應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

右旋糖酐T70、T500、T2000及藍色葡聚糖購自上海麥克林生化有限公司，常用化學試劑購自國藥集團化學試劑有限公司，蛋白胨購自Sigma公司。

1.2 菌株篩選

平板篩選培養基(g/L)：右旋糖酐9，藍色葡聚糖1，硝酸鈉3，磷酸氫二鉀1，硫酸鎂0.5，硫酸錳0.01，氯化鉀 0.5，瓊脂粉 15-20，pH值為5.5-6.0。

基礎發酵培養基(g/L)：右旋糖酐10，蛋白胨3，磷酸氫二鉀1，硫酸鎂 0.5，pH值為5.5-6.0。

取5 g土樣，加入50 mL 滅菌ddH2O，振蕩30 min后靜置沉淀，取上清分別稀釋1×103-1×107倍后，取100 μL涂布到平板篩選培養基上，28℃靜止培養5-7 d。挑選產生透明圈的菌株，轉接到搖瓶發酵培養基中，28℃、180 r/min震蕩培養5-7 d后，檢測右旋糖酐酶活力[14]。

1.3 菌株鑒定

1.3.1 形態學鑒定

在PDA平板上接種菌株，28℃靜止培養，觀察并記錄菌落形態及顏色。

1.3.2 分子生物學鑒定

收集發酵液中菌絲體，提取基因組DNA。以基因組DNA為模板，以ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)為引物,通過PCR擴增ITS rDNA序列。所得產物送至華大基因公司進行測序，將測序結果與NCBI數據庫已有的ITS rDNA序列進行Blast比對，并利用MEGA的Neighbor-Joining軟件構建系統發育樹，Boot-strap分析重復設置為1 000。

1.4 右旋糖酐酶的活力測定

取1 mL適當稀釋的酶液，加入4 mL 3%的右旋糖酐T70 (0.02 mol/L的醋酸緩沖液配制，指定pH值)，在指定溫度下反應10 min后，利用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法檢測還原糖量[15]。

一個酶活力單位(U)定義為每分鐘釋放1 μmol的還原糖所需的酶量。

1.5 培養基優化

1.5.1 單因素實驗

分別用葡萄糖、蔗糖、果糖、檸檬酸、玉米淀粉、糊精取代基礎發酵培養基中的碳源。接種篩選出的菌株于各培養基中，28℃、200 r/min震蕩培養7 d后檢測右旋糖酐酶活力，探索發酵產酶所需最佳碳源。

分別用酵母粉、尿素、硝酸鈉、硫酸銨等取代基礎發酵培養基中的氮源。接種篩選出的菌株于各培養基中，28℃、200 r/min震蕩培養7 d后檢測右旋糖酐酶活力，探索發酵產酶所需最佳氮源。

在最佳碳源和最佳氮源組成的培養基中，分別添加不同的無機鹽：硫酸鎂、氯化鉀、氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸錳、硫酸亞鐵、氯化鈣等。接種篩選出的菌株于各培養基中，28℃、200 r/min震蕩培養7 d后檢測右旋糖酐酶活力，檢測無機鹽對篩選出的菌株發酵產酶的影響，以未添加無機鹽的培養基作為對照。

1.5.2 響應面實驗

1.5.2.1 Plackett-Burman實驗

根據單因素實驗結果，選取6個因素進行PB實驗設計，每個因素取兩個水平：低水平“-1”和高水平“+1”。

1.5.2.2 最陡爬坡實驗

結合PB實驗結果選出的顯著因素，設計它們的變化方向和步長進行最陡爬坡實驗，使各因素的取值更臨近最佳值區域，為響應面實驗做好準備。

1.5.2.3 Box-Benhnken Design (BBD)實驗

在最陡爬坡實驗確定的實驗因素中心點基礎上，根據BBD中心組合設計原理，設計3因素3水平共15個實驗點的響應面分析。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選

從土壤中篩選得到一株右旋糖酐酶產生菌株DJ72，該菌株能夠在篩選平板培養基上形成明顯透明圈，接種到基礎發酵培養基培養7 d后，所產右旋糖酐酶活力達98 U/mL。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態學鑒定

將菌株在PDA平板培養基上培養3 d后，菌落生長整齊，顯白色或淡黃色，呈絨毛狀(圖1a)，在顯微鏡下觀察，菌絲有隔、分枝。小分生孢子呈紡錘狀或卵圓形，大分生孢子呈梭形或月牙形(圖1b)

圖1 菌株DJ72的形態學特征

2.2.2 分子生物學鑒定

提取菌株DJ72的總DNA并作為模板，應用通用引物ITS1和ITS4作為引物，克隆得到其ITS rDNA序列，經測序獲得一條 521 bp的核苷酸序列，同源性比對分析表明，其與腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)菌株的同源性最高，達100%(圖2)。

圖2 菌株DJ72的系統進化分析

根據形態學及分子生物學鑒定結果，菌株DJ72為腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)。將DJ72保藏在中國微生物菌種保藏中心，保藏編號為CGMCC No.14542。

2.3 培養基單因素優化

2.3.1 碳源對DJ72發酵生產右旋糖酐酶的影響

用不同的碳源取代基礎發酵培養基中的右旋糖酐T500，經搖瓶震蕩發酵7 d后檢測右旋糖酐酶活力。實驗結果表明，右旋糖酐相比其他碳源更有利于右旋糖酐酶的發酵，其中以分子量更大的右旋糖酐T2000為碳源所產酶活力更高(圖3)。

圖3 碳源對DJ72發酵生產右旋糖酐酶的影響

2.3.2 氮源對DJ72發酵生產右旋糖酐酶的影響

用不同的氮源取代基礎發酵培養基中的氮源，經搖瓶震蕩發酵7 d后檢測右旋糖酐酶活力。實驗結果表明，蛋白胨與尿素的組合最利于DJ72發酵生產右旋糖酐酶(圖4)。

圖4 氮源對DJ72發酵生產右旋糖酐酶的影響

2.3.3 無機鹽對DJ72發酵生產右旋糖酐酶的影響

在最佳碳源和氮源的基礎上添加不同的無機鹽，經搖瓶震蕩發酵7 d后檢測右旋糖酐酶活力。實驗結果表明，硫酸鎂、磷酸氫二鉀和硫酸亞鐵有利于DJ72發酵生產右旋糖酐酶(圖5)。

圖5 無機鹽對DJ72發酵生產右旋糖酐酶的影響

2.4 培養基響應面優化

2.4.1 Plackett-Burman實驗結果

根據單因素實驗結果，選取6個因素進行考察，采用試驗次數N=12的 PB進行設計。6個因素分別為右旋糖酐T2000、尿素、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵，分別對應表1中A、B、D、E、G和H列。每個因素取兩個水平：低水平“-1”和高水平“+1”。另設兩個虛擬列，考察實驗誤差，分別為C和F列。具體實驗設計和結果分析見表1和表2。

表1 Plackett-Burman實驗設計與響應值Table 1 Plackett-Burman experiment design and response values

從表2可以看出，在PB設計的兩個水平范圍內，尿素、蛋白胨和右旋糖酐對酶活力具有顯著影響，影響力大小為尿素>蛋白胨>右旋糖酐。因此，對這3種因素開展更進一步研究。為節約成本，今后實驗中其余成分取最低值。

表2 Plackett-Burman實驗因素水平和效應分析Table 2 Factor levels and effect analysis in Plackett-Burman experiments

2.4.2 最陡爬坡實驗

由PB實驗結果選取尿素、蛋白胨以及右旋糖酐等3個因素進行最陡爬坡實驗，根據這3個因素的效應大小比較，設定它們的變化方向和步長，結果見表3。從實驗結果可知，最佳發酵條件可能在實驗3附近，因此以實驗3的條件為響應面實驗的中心點。

表3 最陡爬坡實驗設計及結果Table 3 Design and results of the steepest climbing experiment

2.4.3 Box-Benhnken Design (BBD)實驗結果

在PB實驗及最陡爬坡實驗結果的基礎上，對右旋糖酐、蛋白胨及尿素3個變量對右旋糖酐酶發酵結果的影響進行考察，采用響應面法進行優化，實驗結果如表4。

表4 Box-Benhnken 實驗方案及結果Table 4 Box-Benhnken experiment design and results

通過 Design Expert 軟件對表4中實驗結果進行二次多元回歸擬合，得到二次多元回歸方程：Y=227.33+0.50A+5.13B+4.63C-14.75AB-16.25AC-14.00BC-16.42A2-16.17B2-16.17C2，其中Y為右旋糖酐酶活力。進一步對該模型進行方差分析，結果如表5。

表5 方差分析結果Table 5 Analysis of variance for the quadratic model

續表5Continued table 5

各因素之間交互作用及其對右旋糖酶活力影響如圖6所示，在3個因素的取值范圍內，右旋糖酐酶活力均存在最大值。從圖6a可知，蛋白胨與右旋糖酐交互作用明顯，在一定范圍內隨著蛋白胨和右旋糖酐取值不斷增大，右旋糖酐酶活力不斷增大，然后開始降低。從圖6b可知，尿素與右旋糖酐交互作用明顯，過高或過低的取值都會使酶活力降低。從圖6c可知，尿素與蛋白胨對右旋糖酐酶活力影響極為顯著，表現為陡峭的曲面。

圖6 各因素交互作用圖

根據回歸模型預測右旋糖酐酶活力最大為228 U/mL，此時右旋糖酐T2000用量為11.88 g/L，蛋白胨用量為7.15 g/L，尿素用量為3.14 g/L。根據預測結果進行驗證實驗，平行3次所得右旋糖酐酶活力分別為227，227，229 U/mL，平均值為227.66 U/mL，與預測結果基本一致。

因此，經過優化，確定腐皮鐮刀菌DJ72發酵生產右旋糖酐酶的最佳配方為右旋糖酐T2000 11.88 g/L，蛋白胨7.15 g/L，尿素 3.14 g/L，磷酸氫二鉀1.50 g/L，硫酸鎂0.20 g/L，硫酸亞鐵0.05 g/L。

3 討論

提高右旋糖酐酶發酵產量的方法有很多，如Li等[16]采用補料分批發酵和兩步發酵法提高了右旋糖酐酶的活力，分別為159.50和187 U/mL。吳敏等[17]通過基因工程的方法將右旋糖酐酶酶活力提高到240 U/mL。其中，響應面法是運用較多并且行之有效的培養基優化方法，如曹研研等[18]通過響應面法優化棘孢青霉菌的發酵條件，將右旋糖酐酶酶活力提高了88%。楊帆等[19]通過響應面法優化圓弧青霉發酵右旋糖酐酶的發酵培養基，將酶活力提高1.7倍。本研究通過響應面法優化腐皮鐮刀菌DJ72發酵產右旋糖酐酶的培養基成分，與初始發酵培養基相比，右旋糖酐酶活力從98 U/mL提升至228 U/mL，酶活力提升1.3倍。

國際上有關右旋糖酐酶生產菌株的報道已有很多，但是有關腐皮鐮刀菌生產右旋糖酐酶的報道較少，迄今為止僅見到Maksimov等[20]發表的一篇相關文章，類似的報道國內尚未見到。本研究是國內首次有關腐皮鐮刀菌生產右旋糖酐酶的報道，該工作一方面擴充了國內有關右旋糖酶來源菌株的范圍，另一方面也為研究人員深入研究右旋糖酐酶提供基礎數據。