斗竹的開花生物學(xué)特性研究

劉海文，趙婉琪，肖 姣，國春策，楊光耀，于 芬*

(1 江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，南昌 330045；2 江西省竹子種質(zhì)資源與利用重點實驗室，南昌 330045)

中國竹林面積約為6.41×106hm2，是重要的森林資源，廣泛應(yīng)用于日常生活的各個領(lǐng)域，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值[1-3]。但竹類植物開花不可預(yù)測，且大多數(shù)竹種開花周期較長，花后即死亡，嚴(yán)重危害竹林的可持續(xù)發(fā)展[4]。全面了解竹類植物的開花規(guī)律特征和生殖生物學(xué)特性，對于竹類植物的系統(tǒng)分類、竹林的可持續(xù)經(jīng)營管理以及遺傳改良都非常必要。近年來有關(guān)竹類植物開花的研究逐漸增多[5-7]，如毛竹(Phyllostachysedulis)、早竹(Ph.violascens)、角竹(Ph.fimbriligula)、雷竹(Ph.violascenscv. Prevernalis)、月月竹(Menstruocalamussichuanensis)、鵝毛竹(Shibataeachinensis)、新小竹(Neomicrocalamusprainii)等[8-14]，但有關(guān)斗竹(Oligostachyumspongiosum)開花的研究未見報道。

斗竹隸屬竹亞科(Bambusoideae)少穗竹屬(Oligostachyum)，廣泛分布于中國廣西地區(qū)林下、林緣地帶。地下莖單軸散生，稈型細(xì)直，通常高約5 m，葉片細(xì)小[15]，是優(yōu)良的園林觀賞綠化竹種。江西農(nóng)業(yè)大學(xué)竹類種質(zhì)園內(nèi)的斗竹1994年移栽自井岡山，于2019年4月份出現(xiàn)開花現(xiàn)象。本研究對斗竹的開花規(guī)律、花器官形態(tài)特征、花后更新等開花生物學(xué)特性以及大、小孢子發(fā)生和雌、雄配子體的發(fā)育進(jìn)行了觀察，并探究了其結(jié)實率低的原因，為竹類植物的系統(tǒng)分類及生殖生物學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)竹類植物種質(zhì)園內(nèi)，地處江西省中部偏北位置，115°49′11″～115°49′23″ E，28°46′00″～28°46′30″ N，海拔49.5 m，屬中亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，年平均氣溫17～17.7 ℃，極端最高氣溫40.9 ℃，極端最低氣溫-15.2 ℃，年日照時數(shù)1 772～1 845 h，年平均降水量1 567.7～1 654.7 mm。地勢平坦，土壤類型為黏重紅壤，微酸性。竹林樣地面積約492 m2。

1.2 研究方法

1.2.1 竹林開花動態(tài)野外觀測了斗竹的花期、開花動態(tài)及林相變化，并統(tǒng)計花后結(jié)實率。開花時期參照Dafni[16]研究進(jìn)行劃分，即開花初期(竹林內(nèi)約25%竹株開花)、開花盛期(竹林內(nèi)50%以上的竹株開花)、開花后期(竹林內(nèi)25%以下的竹株仍在開花)和開花末期(竹林內(nèi)少于10%的竹株仍在開花)。

1.2.2 花器官形態(tài)觀察采集不同發(fā)育階段的斗竹花序，立即放入有冰袋和少量水的保溫箱(4～5 ℃)中。統(tǒng)計各花序內(nèi)小穗數(shù)量、小穗長度、苞片和小花數(shù)量，并觀察各組成部分的數(shù)量、長寬、色澤等特性，ZEISS Stemi 2000體視顯微鏡下進(jìn)行拍照。

1.2.3 石蠟制片和顯微觀察采用石蠟制片法。將固定(70% FAA)后的材料取出，采用Ehrlich’s蘇木精染色液將材料整染24～48 h。系列梯度乙醇脫水，二甲苯進(jìn)行透明，石蠟包埋后于Leica RM 2235旋轉(zhuǎn)切片機(jī)上切取厚度為7～8 μm的切片，置于Zeiss AX10生物顯微鏡下進(jìn)行觀察、拍照。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，Photoshop進(jìn)行圖像處理排版。

2 結(jié)果與分析

2.1 斗竹開花林相及結(jié)實情況

2019年4月下旬至5月下旬，江西農(nóng)業(yè)大學(xué)竹類植物種質(zhì)園內(nèi)的斗竹林出現(xiàn)全體開花現(xiàn)象。斗竹為一次性全體開花的散生竹，花期短，約持續(xù)45 d。相較于營養(yǎng)生長時期，即將開花的斗竹林在外觀上具有明顯變化，表現(xiàn)為竹葉失綠，部分脫落，竹稈微黃，整個竹林呈現(xiàn)衰敗趨勢(圖版Ⅰ，1～2)。2019年4月中旬，花序抽出，成花量極大(圖版Ⅰ，3～4)。5月初少量的花開始開放，開花時由漿片撐開外稃，花藥從內(nèi)部伸出，此階段開放的小花集中于花序頂部小穗的基部(圖版Ⅰ，5)；5月上旬為斗竹的盛花期，竹林內(nèi)一半以上的竹花完全開放，開放的小花多集中于花序頂部小穗的中、下部(圖版Ⅰ，6～7)；5月下旬，花期結(jié)束，花后竹稈變黃，竹葉脫落，小穗枯黃，竹林內(nèi)未發(fā)現(xiàn)實生苗，竹林結(jié)構(gòu)明顯呈衰老趨勢(圖版Ⅰ，8～11)。至2020年3月，斗竹林完全枯死。根據(jù)統(tǒng)計2 780枚斗竹小花的結(jié)實情況，收獲221枚種子，種子多發(fā)育自小穗中、下部的小花，每枚小穗基本都有1枚種子形成，結(jié)實率為8.1%，但小穗上的幼果被蟲蝕空，蟲害嚴(yán)重(圖版Ⅰ，12)。

2.2 花、果形態(tài)結(jié)構(gòu)

斗竹花序為圓錐狀花序，花序柄長4～15 cm，每花序含4枚小穗，具小穗柄，小穗柄較短，長約2 cm，被柔毛(圖版Ⅱ，1)；小穗細(xì)長，長約4～10 cm，基部具3枚苞片，第1枚苞片長約3 mm，第2枚苞片長約5 mm，第3枚苞片與外稃大小相似，長約1 cm，苞片內(nèi)無小花。每枚小穗含小花5～17朵，頂部小花不發(fā)育(圖版Ⅱ，2)；小花由外稃、內(nèi)稃、漿片、雄蕊、雌蕊組成(圖版Ⅱ，3)；內(nèi)、外稃片各1枚，外稃青綠色，長約12 mm，披針形，頂端尖銳，邊緣紫紅色，脊間2脈，被白毛(圖版Ⅱ，4)；內(nèi)稃披針形，對生于外稃內(nèi)側(cè)，長約10 mm，頂端2裂(圖版Ⅱ，5)；漿片3枚，長2～3 mm，寬約2 mm，1枚漿片包被于內(nèi)稃中，另外2枚漿片貼近外稃，卵圓形，頂端被纖毛，具多條縱脈(圖版Ⅱ，6)；雄蕊為4～6枚(多為6)，花藥長7～10 mm，幼時黃綠色，成熟后為黃色，密被紫色斑點(圖版Ⅱ，7～9)；雌蕊1枚，子房長橢圓形，表面平滑無毛，柱頭3裂，羽毛狀，長2～3 mm(圖版Ⅱ，10)；花粉粒球形，表面紋飾顆粒狀，具單個萌發(fā)孔，萌發(fā)孔具有明顯的內(nèi)凹孔環(huán)(圖版Ⅱ，11)；穎果，橢圓形，去稃果實深褐色，長6～10 mm，直徑約1～3 mm，腹部縱溝槽明顯，花柱宿存(圖版Ⅱ，12)。

2.3 小花開放動態(tài)

斗竹小花為開放型。未開放時外稃緊閉，開花時漿片吸水膨脹撐開外稃，花藥從內(nèi)部伸出(圖版Ⅲ，1～3)；隨后，花絲迅速下垂，柱頭從稃片內(nèi)露出，花藥開始散粉，屬于雌雄同熟型(圖版Ⅲ，4)；花粉主要依靠風(fēng)力及蟲媒傳播；完成散粉后，花絲、花藥回縮，稃片閉合(圖版Ⅲ，5～6)。花藥的露出與散粉受到氣溫、濕度等環(huán)境因素的影響較大，晴天光照強(qiáng)，花藥散粉的速度更快。就整個花序來看，位于花序頂端的小穗先開放，開花順序為自上而下；而就單個小穗來看，開花順序自小穗基部依次向上；通過分別對同一小穗上不同部位的小花進(jìn)行解剖，發(fā)現(xiàn)雄蕊(圖版Ⅳ，A1～E1)和雌蕊(圖版Ⅳ，A2～E2)的發(fā)育順序均為自下而上，即基部的小花先成熟，并依次向上發(fā)育，位于頂部的小花發(fā)育不全，不開放。

2.4 小孢子發(fā)生及雄配子體發(fā)育

斗竹的每枚花藥具有4個小孢子囊(圖版Ⅴ，1)。對長度為0～1 mm花藥進(jìn)行橫切，發(fā)育初始階段花藥橫切面為橢圓形(圖版Ⅴ，2)，隨后在4個角隅處分化出孢原細(xì)胞，橫切面上，花藥角隅處開始突出(圖版Ⅴ，3～4)。花藥長度在1～2 mm時，孢原細(xì)胞進(jìn)行分化，進(jìn)入造孢細(xì)胞時期，初生造孢細(xì)胞經(jīng)過分化、發(fā)育依次形成次生造孢細(xì)胞(圖版Ⅴ，5～6)，進(jìn)而發(fā)育為小孢子母細(xì)胞，此階段花粉壁分化完成，由內(nèi)向外依次為：絨氈層、中層、藥室內(nèi)壁和表皮(圖版Ⅴ，7～8)。花粉母細(xì)胞經(jīng)過前期 Ⅰ-末期 Ⅰ的連續(xù)過程(圖版Ⅴ，9～11)，首次減數(shù)分裂的結(jié)果形成了二分體，第一次減數(shù)分裂期間，中層細(xì)胞開始變得扁平(圖版Ⅴ，12)。緊接著第二次減數(shù)分裂，同樣經(jīng)歷前期Ⅱ、中期Ⅱ、后期Ⅱ(圖版Ⅴ，13)和末期Ⅱ(圖版Ⅴ，14)，沉積胼胝質(zhì)壁，形成左右對稱型的四分體，此階段，中層完全解體(圖版Ⅴ，15)。

雄配子發(fā)育過程始于胼胝質(zhì)壁中釋放出的小孢子，然后細(xì)胞核增大，細(xì)胞壁加厚，中央大液泡形成，細(xì)胞核邊緣化，此時小孢子為單核靠邊期。此階段花粉囊壁僅包括表皮細(xì)胞和藥室內(nèi)壁細(xì)胞各一層，橫切面上表皮細(xì)胞呈方形，體積顯著增大并具有明顯的角質(zhì)層，藥室內(nèi)壁細(xì)胞的細(xì)胞壁發(fā)生帶狀加厚，而中層、絨氈層已完全降解(圖版Ⅴ，16)。小孢子在進(jìn)行了1次不對等的有絲分裂后，形成2個大小不等的核，較大、居中的為營養(yǎng)核，貼近花粉壁的為生殖核，斗竹成熟花粉粒為2-細(xì)胞型(圖版Ⅴ，17)。花粉發(fā)育過程中也出現(xiàn)異常收縮及空腔的敗育花粉粒(圖版Ⅴ，18～20)。

2.5 大孢子及雌配子體發(fā)育

斗竹子房珠被2層，為厚珠心。發(fā)育初期，在珠心表皮下形成一個細(xì)胞，其形態(tài)顯著區(qū)別于其他細(xì)胞，細(xì)胞體積大，細(xì)胞核較大、居中，細(xì)胞質(zhì)濃厚，即孢原細(xì)胞；大孢子母細(xì)胞由孢原細(xì)胞直接發(fā)育，其細(xì)胞核增大(圖版Ⅵ，1)。隨后，大孢子母細(xì)胞開始進(jìn)入減數(shù)分裂階段。經(jīng)過第一次減數(shù)分裂，大孢子母細(xì)胞分裂形成二分體(圖版Ⅵ，2)；第二次減數(shù)分裂時二分體的兩個細(xì)胞各自分裂在沿著珠孔下方的珠心形成四分體。

成熟胚囊為蓼型。功能大孢子的細(xì)胞核在第一次有絲分裂后，形成的2個細(xì)胞分別向細(xì)胞兩端移動，形成2核胚囊(圖版Ⅵ，3)；第二、三次有絲分裂后，分別形成4核胚囊(圖版Ⅵ，4～5)和8核胚囊；珠孔端、合點端各有1個細(xì)胞核向胚囊中央游移，組成極核(圖版Ⅵ，6)；靠近合點端的3個細(xì)胞反復(fù)分裂組成反足細(xì)胞群(圖版Ⅵ，7)；位于珠孔端的3個細(xì)胞核呈“品”形，包括1個卵細(xì)胞和2個助細(xì)胞共同組成卵器(圖版Ⅵ，8～9)；反足細(xì)胞、中央細(xì)胞核和卵器共同組成成熟胚囊，雌配子體形成。

3 討 論

竹類植物作為無性系克隆的多年生植物，往往需要經(jīng)歷漫長的生長過程才會開花結(jié)實，其開花特點具有共同性即開花周期長、缺乏規(guī)律性、花后死亡等[17-18]。然而，開花竹種之間也存在一定的差異，主要表現(xiàn)在開花習(xí)性、花后結(jié)實率以及竹林更新繁殖方式上。竹子開花習(xí)性復(fù)雜多樣，Zheng等[19]基于對630多種竹類植物開花結(jié)實信息的分析，根據(jù)收集到的大量例子，認(rèn)為竹子開花習(xí)性可分為4種類型：零星開花、群體同步開花、群體同步開花和零星開花相結(jié)合以及部分開花[20]。群體開花后死亡會對竹種種質(zhì)資源造成嚴(yán)重的威脅，珍稀竹種針麻竹(Cephalostachyumscandens)和貢山竹(Gaoligongshaniamegathyrsa)由于自然開花處于瀕危狀態(tài)[21]；浙江上虞林業(yè)科技重點推廣竹種——角竹大面積開花枯死，導(dǎo)致林農(nóng)損失慘重，竹種資源保存出現(xiàn)危機(jī)[22]。根據(jù)連續(xù)兩年對斗竹的開花林相進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，斗竹屬于一次性、大量同步開花類型，花期非常短，且花后次年竹林整體衰敗死亡造成對其生殖生物學(xué)的研究受限。

在自然界中，花后竹類植物通過有性繁殖和無性繁殖的方式進(jìn)行更新。研究表明大部分野生竹種依靠有性繁殖進(jìn)行更新，結(jié)實率高達(dá)79%，而栽培種則多以無性更新方式繁衍后代，結(jié)實率較低為27%，大部分通常不結(jié)實，或出現(xiàn)種子敗育現(xiàn)象[23]；程有龍等[22]研究栽培角竹發(fā)現(xiàn)，因長期來依靠無性繁殖方式繁衍后代，其有性繁殖機(jī)能明顯退化，而分布在懸崖峭壁上的開花爬竹(Ampelocalamusscandens)開花后結(jié)實量大，種子飽滿，完全可以進(jìn)行天然更新[24]。江西農(nóng)業(yè)大學(xué)竹類植物種質(zhì)園內(nèi)的斗竹為移栽竹種，通過統(tǒng)計花后2 780枚小花的結(jié)實情況發(fā)現(xiàn)，斗竹的結(jié)實率為8.1%，結(jié)實率較低。

影響竹類植物結(jié)實率的因素很多，如雌雄蕊敗育、開花時空特性限制、傳粉有效率低、生境條件不適等[25-27]。張文燕等[28]對五月季竹(Ph.reticulata)開花結(jié)實研究發(fā)現(xiàn)，花藥和花粉敗育影響其結(jié)實量，結(jié)合自然授粉不良、雌蕊畸形等綜合因素導(dǎo)致其基本無結(jié)實。根據(jù)對水竹(Ph.heteroclada)開花生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，雌蕊發(fā)育異常導(dǎo)致柱頭可授率低是其有性生殖過程中的薄弱環(huán)節(jié)，同時多雨潮濕的氣候條件導(dǎo)致花器官發(fā)育完全被昆蟲幼蟲破壞[29]。袁金玲等[30]發(fā)現(xiàn)綠竹屬的3個竹種均因雌蕊退化而難以結(jié)實；孝順竹(Bambusamultiplex)的子房、胚珠均發(fā)生早期敗育，且雌蕊結(jié)構(gòu)異常，造成其結(jié)實率低[31]；林樹燕[32]對鵝毛竹(Shibataeachinensis)研究發(fā)現(xiàn)因柱頭的不外露和不可授性，加上花粉本身的敗育，使其自然授粉率基本為零。

斗竹的胚囊發(fā)育正常，但花粉存在不同程度的敗育，存在畸形花粉和空腔花粉現(xiàn)象，僅有少數(shù)正常花粉粒，花粉敗育可能是影響斗竹結(jié)實率的原因之一。此外，竹林蟲害影響嚴(yán)重、花期雨水過多等多方因素可能造成了斗竹結(jié)實率降低。而且花后斗竹林無鞭生新竹株，也未見實生苗，因此斗竹的花后更新方式為有性繁殖，但栽培斗竹的花粉敗育以及外部環(huán)境影響共同導(dǎo)致其結(jié)實率較低。

4 結(jié) 論

斗竹為一次性全體開花的散生竹，花期為4月下旬～5月下旬，盛花期為5月上旬，成花量大。圓錐狀混合花序，每枚花序含4枚小穗，每枚小穗具小花5～17朵，小花為開放型穎花，由1枚內(nèi)稃、1枚外稃、3枚漿片、1枚雌蕊(柱頭3裂，羽毛狀)、4～6枚雄蕊(多為6枚)組成，雌雄同熟。同一花序內(nèi)小穗均向基發(fā)育，而同一小穗內(nèi)不同部位的小花均向頂發(fā)育。果實為穎果。自然條件下結(jié)實率8.1%，竹林更新以有性繁殖為主。

花藥具4個藥室，花藥壁發(fā)育為基本型，由表皮、內(nèi)壁、中層和絨氈層4層細(xì)胞組成。小孢子四分體為左右對稱型，減數(shù)分裂時胞質(zhì)分裂為連續(xù)型，成熟花粉粒為2-細(xì)胞型；花粉存在敗育現(xiàn)象，出現(xiàn)畸形或空腔花粉粒。雌蕊結(jié)構(gòu)均完整，子房皆為單心皮1室，胚珠倒生，厚珠心；胚囊為蓼型，發(fā)育正常，成熟胚囊由卵器、極核和反足細(xì)胞群構(gòu)成。本研究探討了斗竹的開花特性、花器官形態(tài)特征及其大小孢子和雌雄配子體的發(fā)育，為該屬系統(tǒng)分類及生殖生物學(xué)提供基礎(chǔ)資料。