Beagle犬藥物誘導急性腎損傷模型的研究

白玉杰，霍桂桃，楊艷偉，孫立，苗玉發，周曉冰，李波

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是一種臨床常見的危重病癥，輕者腎臟結構受損，重者腎臟功能紊亂，甚至導致患者死亡。據估計，藥物性急性腎損傷占所有 AKI 病例的 25%，在老年患者中甚至高達 60%[1]。由于傳統腎損傷標志物血清尿素氮（BUN）和肌酐（CRE），在腎功能顯著喪失之前無法充分顯示腎毒性，導致藥物腎毒性在藥物開發過程中經常被低估，因此，尋找新型的腎毒性生物標志物是預防藥物性腎損傷的有效策略[2]。但由于不同毒性機制藥物會影響腎臟的不同部位，而不同病因、不同損傷部位甚至不同病變時期，各生物標志物的表現又不完全相同，理想的腎毒性生物標志物要求既能快速靈敏地反映早期輕微腎損傷，又能識別腎損傷的具體部位（如腎小球或腎小管）[2-4]。因此，建立不同類型的 AKI 動物模型，對于篩選靈敏特異的腎毒性生物標志物具有重要意義。

目前，新型腎毒性生物標志物的研究主要集中在 AKI 病人和嚙齒類動物模型上[3-4]，而犬作為藥物安全性評價常用的動物種屬，尚缺乏新的腎毒性生物標志物的研究數據。因此為拓寬這些潛在的標志物在非嚙齒類動物上的適用性，建立可靠的大型動物——犬的藥物腎損傷模型，并以此開展犬腎毒性生物標志物的相關研究迫在眉睫。本研究選用腎小管損傷陽性藥物順鉑建立 Beagle 犬急性腎損傷模型，確定不出現嚴重毒性反應同時又能造成適度腎臟損傷的適宜劑量及給藥方案，同時開展新的生物標志物的初步研究，為探索靈敏、特異的 Beagle犬新型腎毒性生物標志物提供試驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物與飼養條件 雄性 5～6月齡Beagle 犬，普通級，購自北京瑪斯生物技術有限公司，合格證號 SCXK（京）2011-0003。Beagle 犬單籠飼養，籠具每日清洗，動物定量喂食，自由飲水，采尿期間禁食禁水；溫度：15～25 ℃，日溫差≤ 4 ℃，濕度：40%～70%，換氣次數 8～10 次/h，每天光照時間 12 h。

1.1.2 主要試劑和儀器 注射用順鉑凍干粉針劑（批號：4060221）購自齊魯制藥有限公司；犬Clusterin ELISA 試劑盒（批號：E15-066）購自捷克 Biovender 公司；白蛋白（Albumin）檢測試劑盒（批號：607 850-01）購自美國 Roche 公司；CRE、BUN 生化檢測試劑全部購自日本 Wako 公司；MINI AM4290 尿分析儀購自日本京都第一科學株式會社；7180 型全自動生化分析儀購自日本日立公司；全波長酶標儀 SpectraMax Plus 購自美國Molecular Devices 公司；Luminex 200TM液相芯片懸浮系統購自美國 Luminex 公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 Beagle 犬經過 2 周檢疫馴化合格后，參照相關文獻[3-4]，設定給藥劑量、給藥途徑、解剖時間點，設定 3、4 和 5 mg/kg 三個給藥劑量，順鉑凍干粉用 0.9% 氯化鈉注射液配制成1 mg/ml 順鉑注射液。給藥方式為微量注射泵單次靜脈注射，每個劑量 1 只動物，觀察 16 d，試驗期間每日觀察動物臨床癥狀，給藥前、給藥后每隔一天或兩天收集動物 16 h 過夜尿液（固定于下午5 點至次日上午 9 點收集）。收集完尿液后采集犬前肢內側靜脈血液，靜置 30～60 min 待血液凝固，4 ℃，3000 r/min 離心 10 min，分離血清用于BUN、CRE 測定。在各組動物觀察最后一天進行解剖，對動物進行大體病理學檢查，收集動物的腎臟于 10% 福爾馬林固定液中保存，用于組織病理學檢查。

1.2.2 血清和尿液生物標志物檢測 采用全自動生化分析儀對動物血清中 BUN 和 CRE 以及尿液中 CRE 和 Albumin 的濃度進行測定；此外，按照試劑盒說明書，使用酶聯免疫方法（ELISA）測定動物尿液中叢生蛋白（Clusterin）濃度；并按照產品說明書，使用 Luminex 方法測定尿液中骨橋蛋白（OPN）和單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）濃度。對超過檢測限的樣本，改變稀釋濃度后重新檢測。

1.2.3 組織病理學檢查 將腎臟固定后經修塊取材，依次進行脫水、包埋、切片以及蘇木精-伊紅（HE）染色，最后鏡檢。腎臟組織病理學評分分級標準參照文獻[5]，包括無（-）、極輕度（+）、輕度（++）、中度（+++）、重度（++++）和極重度（+++++）。

1.2.4 試驗數據處理和分析 尿液生物標志物檢測結果數據均使用同時期尿 CRE 數據進行標準化，并采用 GraphPad Prism 5 制作數據圖例。

2 結果

2.1 給藥后動物臨床癥狀

給藥劑量為 3 mg/kg 時，動物僅在給藥第1 天發生輕度嘔吐，食欲下降，隨后恢復正常；而 4 和5 mg/kg 給藥劑量時，動物自給藥第1 天就開始發生嚴重嘔吐、食欲下降、腹瀉、脫水、體重下降、活動量減少等臨床癥狀，4 mg/kg 動物在第6 天瀕臨死亡，進行解剖，而 5 mg/kg 動物在給藥第10 天死亡。

2.2 腎臟組織病理學檢查結果

組織病理學分析結果發現，給藥劑量為 3 mg/kg動物的腎臟出現輕度腎小管變性、壞死和腎小管變性、再生，間質、炎性細胞浸潤和腎小管蛋白管型（圖1A），而在給藥劑量為 4 mg/kg 和 5 mg/kg動物死亡解剖的組織病理學檢查發現，這 2 只動物腎臟發生了中度腎小管變性、壞死或再生以及輕度的間質、炎性細胞浸潤和腎小管蛋白管型（圖1B）。

圖1 Beagle 犬單次靜脈注射不同劑量順鉑后腎臟組織病理學檢查結果（A：3 mg/kg 給藥劑量；B：5 mg/kg 給藥劑量；紅色箭頭：指向腎小管上皮細胞變性、壞死部位；藍色箭頭：指向腎小管變性、再生部位；黑色箭頭：指向間質、炎性細胞浸潤部位；綠色箭頭：指向腎小管蛋白管型部位）Figure 1 The results of histopathological examination for kidney in Beagle dogs after a single intravenous injection of different doses of cisplatin (A:The result from the animal with a dose of 3 mg/kg; B:The result from the animal with a dose of 5 mg/kg; Red arrow:points to the area of renal tubular epithelial cell deformation and necrosis; Blue arrow:points to the area of renal tubular deformation and regeneration; Black arrow:points to the interstitial and inflammatory cell infiltration area; Green arrow:points to the tubular protein cast)

2.3 血清腎損傷生物標志物的變化

傳統血清腎損傷生物標志物分析結果顯示，給藥劑量為 3 mg/kg 的動物體內血清 BUN 和 CRE濃度，與給藥前相比，只是略有輕微的升高，基本處于正常范圍（圖2）；而 4 和 5 mg/kg 給藥劑量的動物體內血清 BUN 和 CRE 發生了明顯升高，與給藥前相比，在第6 天，4 和 5 mg/kg 動物體內的 BUN 濃度分別升高了 12.5 和 15.8 倍，而CRE 升高了 7.9 倍和 6.1 倍（圖2）。

圖2 Beagle 犬單次靜脈注射不同劑量的順鉑后血清尿素氮（A）和肌酐（B）水平的變化Figure 2 Changes of serum BUN (A) and CRE (B) levels in Beagle dogs after a single intravenous injection of different doses of cisplatin

2.4 尿液生物標志物的變化

為了進一步評價 Beagle 犬急性腎損傷模型，對出現輕度腎損傷動物尿液中的生物標志物進行檢測分析，結果顯示給藥劑量為 3 mg/kg 時，動物尿液中叢生蛋白在第2 天出現升高，并持續上升，給藥第16 天與給藥前相比升高了 80.3 倍；第4 天尿液中出現少量的白蛋白，在第8 天達到頂峰，隨后逐漸下降（圖3）。

而 Luminex 方法分析結果也發現其他兩種新型生物標志物 OPN、MCP-1 在給藥后也發生了明顯的升高，給藥第6 天，動物尿液中 OPN 濃度增加，并持續增長，第10 天 OPN 濃度為給藥前6.5 倍。而 MCP-1 濃度從給藥第6 天持續增長，到第16 天，增加倍數為給藥前的 11.5 倍（圖3）。

圖3 Beagle 犬單次靜脈注射 3 mg/kg 順鉑后尿液中生物標志物水平的變化（A：叢生蛋白；B：白蛋白；C：骨橋蛋白；D：單核細胞趨化蛋白-1）Figure 3 Changes of urine biomarker levels in Beagle dogs after a single intravenous injection of 3 mg/kg cisplatin (A:Clusterin;B:Albumin; C:OPN; D:MCP-1)

3 討論

在大鼠 AKI 動物模型制備中，慶大霉素和順鉑為最常用的急性腎小管損傷模型的陽性藥物，前期試驗中通過連續 9 天給 Beagle 犬肌肉注射80 mg/kg 慶大霉素，成功建立了犬急性腎損傷模型[6]。盡管兩者均可引起腎小管損傷，但順鉑不同于慶大霉素的是單劑量靜脈注射就可引起典型腎臟病變，其腎毒性的機制主要通過下調腎臟轉運蛋白介導的攝取以及基底膜外側有機陽離子和陰離子轉運蛋白，導致腎臟中順鉑的濃度遠高于血清，尤其是在近端小管中[7-8]。順鉑在近端小管上皮細胞中積累后形成鉑絡合物，鉑絡合物與 DNA 相互作用，引起 DNA 單鏈和雙鏈斷裂，導致毛細血管擴張性共濟失調癥突變蛋白激酶活化，磷酸化并激活p53 蛋白，造成腎小管上皮細胞凋亡和壞死并伴有明顯的炎癥[9]。

有文獻報道 Beagle 犬單次靜脈注射 5 mg/kg順鉑可引起急性腎衰竭[10]。本研究中，我們選用的3、4 和 5 mg/kg 給藥劑量下，動物腎臟均出現腎小管損傷病變，但發現動物在接受 4、5 mg/kg 給藥劑量后，臨床癥狀嚴重，且給藥后 6～10 天死亡，表明給藥劑量過大。而在 3 mg/kg 給藥劑量下，傳統的腎毒性標志物 BUN、CRE 升高幅度輕微，腎臟病變損傷程度為輕度，更適宜用于評估早期、靈敏的腎臟損傷標志物，因此建議 3 mg/kg 順鉑為Beagle 犬急性腎損傷模型的最佳給藥劑量。

與以前發表結果相類似，傳統血清腎損傷生物標志物 BUN 和 CRE 濃度，僅在腎損傷較為嚴重的 4 和 5 mg/kg 給藥劑量動物的體內出現明顯升高，而在 3 mg/kg 給藥劑量動物體內僅略有輕微的升高，進一步表明在非嚙齒類急性腎損傷模型中BUN 和 CRE 用于診斷腎損傷的不足[6]。

目前在大鼠動物模型中已批準叢生蛋白、白蛋白和腎損傷因子-1（Kim-1）等 8 種腎毒性生物標志物可以用于藥物臨床前安全性評價[11]。為了進一步評估新的腎毒性生物標志物在 Beagle 犬急性腎損傷模型中的變化，我們也測定了 3 mg/kg 順鉑給藥劑量下動物尿液中叢生蛋白和白蛋白的濃度，發現這兩個生物標志物在藥物誘導腎損傷早期就出現明顯改變，并且持續增長。在慶大霉素誘導犬急性腎損傷模型中也證實叢生蛋白濃度在發生腎損傷時顯著性升高[6]，進一步支持叢生蛋白可作為在犬動物模型中進行藥物臨床前的腎小管毒性安全性評價候選生物標志物。近些年，一些新的生物標志物不斷被報道，例如 OPN 和 MCP-1，在嚙齒類腎損傷動物模型和藥物腎損傷病人的尿液中濃度顯著升高[12-13]。本研究結果也發現 Beagle 犬在接受 3 mg/kg 順鉑給藥后，動物尿液中 OPN 和MCP-1 明顯增加，這些結果不僅進一步支持本研究所用建模的藥物濃度的合理性，而且獲得了兩個生物標志物的動態變化數據，為后續研究提供了研究方向。

盡管本研究采用動物數量較少，且大動物之間可能存在個體差異，但整體腎損傷傳統或四種新型標志物試驗結果與動物的腎臟病理學檢查結果一致。這些結果也表明 Beagle 犬單次靜脈注射3 mg/kg 順鉑可成功建立急性腎小管損傷模型。事實上，基于本研究結果給藥劑量為 3 mg/kg 順鉑建立急性腎小管損傷模型的其他新型腎毒性生物標志物及病理學結果也進一步證實其建模給藥劑量的合理性（結果另文發表），這些研究結果為后續在非嚙齒類動物中發現早期、靈敏、特異的藥物臨床前腎毒性生物標志物研究奠定基礎。