細胞中同時檢測特定標志物蛋白和基因表達方法的建立

賈坤，蘇建榮

組織切片中常采用免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）和熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）對特定標志物的蛋白和基因水平進行檢測，其對生物醫學基礎研究、預防臨床醫學的研究、軍事醫學的應用研究以及病理的輔助診斷等方面都具有重要意義[1-2]。免疫組織化學是指利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記在抗體上的顯色物質（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來檢測組織細胞抗原，對其進行定位、定性和定量檢測的技術[1]。熒光原位雜交是依據堿基互補原理，應用熒光素直接或間接標記的核酸探針在復制切片、細胞涂片、染色體輔片上檢測間期細胞核染色質數量即結構變化，進行定性和相對定量的分析檢測技術[2]。采用免疫組織化學和熒光原位雜交兩種方法分別在蛋白和基因水平對特定標志物的表達進行檢測，從而為臨床提供輔助的診斷信息。在大多數情況下兩者的檢測結果是一致的，即標志物基因和蛋白水平的表達存在明確的相關性[3]，然而在有些情況下，由于翻譯后修飾和基因表達調控等原因，特定標志物基因和蛋白表達水平不完全一致，這種情況下就需要將兩種方法聯合起來進行檢測[4-5]。常規的做法是在兩張切片中分別進行 IHC 和 FISH的檢測，首先在 IHC 染色片子上確定待復核的區域；然后在 FISH 標本上低倍鏡下找到相同的組織細胞結構，采用高倍鏡進一步的觀察。該方法受切片質量、腫瘤異質性、染色過程等的影響[4-6]。

本文建立了一種在同一張片子上同時對特定標志物進行蛋白和基因水平檢測的方法，聯合蛋白的 IHC 和基因的 FISH 檢測方法，在同一張片子上進行同一種標志物蛋白水平和基因水平的檢測，提高這兩種方法的匹配度和適用性，可為臨床提供更好的輔助診斷方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人乳腺癌細胞系 JIMT-1 購自上海子實生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑及儀器 兔抗人 HER2 單克隆抗體 ab214275、兔抗人 pan-CK 單克隆抗體ab234297、兔抗人 Ki67 單克隆抗體 ab92742、Alexa Fluor 488 標記山羊抗兔熒光二抗均購自Abcam 公司；抗兔二抗 SP 試劑盒、DAB 顯色液購自北京中杉金橋公司；Alexa Fluor 555 標記的HER2 基因探針購自美國雅培公司；胎牛血清、RPMI1640 培養基、 胰蛋白酶均購自美國Sigma-Aldrich 公司；細胞培養箱購自美國 Napco公司；超凈工作臺購自北京冠鶴凈化設備有限公司；原位雜交儀 Hydridizer 購自丹麥 Dako 公司；熒光顯微鏡 Nikon-Ni 購自日本尼康公司。

1.2 方法

1.2.1 JIMT-1 細胞培養和細胞涂片的制備 細胞采用含有 10% 胎牛血清和 1% 雙抗（青霉素和鏈霉素）的 RPMI1640 完全培養基進行培養，待細胞融合度 80%～90% 時，采用 1×PBS 洗滌3 次后，胰蛋白酶消化 3 min，完全培養基終止后，800 r/min 離心 5 min，棄上清，得到細胞沉淀，然后采用培養基重懸后傳至 2～3 個新的培養瓶中進行培養。

1.2.2 腫瘤細胞系涂片中 HER2 免疫熒光和熒光原位雜交檢測 ①預處理：培養的 JIMT-1 細胞系，消化后離心，取細胞懸液涂片在 1 cm×1 cm組化框的載玻片上，自然干燥后，采用 4% 的多聚甲醛固定 10 min；②免疫組化檢測：采用免疫組化染色 SP 三步法對細胞涂片進行染色，抗原在堿性檸檬酸鈉緩沖液中高溫高壓修復，過氧化氫去除內源性過氧化物酶的干擾，山羊血清封閉后，加入一抗 37 ℃ 孵育 1 h，后續處理采用 SP 和 DAB 顯色試劑盒中提供步驟對細胞涂片進行免疫組織化學染色；③熒光原位雜交檢測：將載玻片浸入 37 ℃預熱的 2×SSC 中 5 min，然后依次采用預冷的75%、85%、100% 乙醇脫水，切片風干后，加入HER2 探針，蓋上蓋玻片后用封片劑外封，置于雜交儀中，設置變性 76 ℃ 10 min，雜交 37 ℃ 24 h；雜交后洗滌，依次采用 43 ℃ 預熱的甲酰胺和含有0.1% Triton X-100 的 2×SSC 分別洗滌 2 次，每次 5 min，采用含有防淬滅劑的 DAPI 染色液進行封片；④免疫熒光檢測：將固定后的載玻片浸入1×PBS 中，浸泡 5 min，采用含有 0.2% Triton X-100 的 1×PBS 透化處理 5 min，然后加入10% 的山羊血清封閉 30 min；采用 2% 的山羊血清稀釋 HER2 抗體，滴加在標本區，37 ℃ 孵育1 h，采用 PBST 洗滌后加入熒光二抗染色 37 ℃30 min，PBST 洗滌后采用含有防淬滅劑的 DAPI染色液進行封片；⑤免疫熒光和熒光原位雜交聯合檢測：采用先進行基因的 FISH 后進行蛋白的免疫熒光檢測的方法進行聯合檢測，具體的步驟為：先參照 FISH 的檢測方法，一直到雜交后的洗片，不進行 DAPI 封片，直接進行 IF 染色中的 PBS洗片和后續處理。

1.2.3 觀察 染色后的片子采用熒光顯微鏡觀察，分別在橙色通道、綠色通道和藍色通道下對HER2 的基因擴增、蛋白的表達和細胞核進行觀察。陽性結果判定：藍色通道下細胞核聚集并且輪廓清晰；免疫熒光檢測中綠色通道下目的蛋白檢測為明顯的一圈或者一片，細胞定位與理論相符，背景信號無或弱；熒光原位雜交檢測中橙色通道下為細胞核區域的明顯點狀著色，靶點信號強，背景信號無或弱；陰性結果判定為：沒有細胞核著色或者細胞核散、綠色通道無著色或者不是細胞膜定位、FISH 信號不是明顯的點狀著色而是一片，包含有以上任意情況均認為是陰性結果。

2 結果

2.1 免疫組化和免疫熒光法檢測JIMT-1 細胞中HER2 表達

采用 JIMT-1 細胞系作為檢測細胞，其為HER2 高表達乳腺癌細胞系，并且 HER2 基因大多為 4 倍體。JIMT-1 細胞涂片中 HER2 蛋白檢測分別參照上述免疫組化和免疫熒光檢測方法，二抗分別采用 Alexa Fluor 488 標記山羊抗兔熒光二抗和 HRP 標記的山羊抗兔酶標二抗。結果如圖1所示：分別采用熒光二抗和酶標二抗均可以在JIMT-1 細胞中檢測到 HER2 蛋白的細胞膜定位，兩者在結果判讀上沒有明顯差異。

圖1 JIMT-1 細胞中 HER2 蛋白表達檢測（400 ×；A：免疫熒光染色；B：免疫組織化學染色）Figure 1 Detection of HER2 expression in JIMT-1 cell(400 ×; A:Immunofluorescence stain; B:Immunohistochemical stain)

2.2 免疫熒光和熒光原位雜交聯合檢測

由于免疫熒光和免疫組化對蛋白標志物的檢測原理是相同的，并且兩者在細胞定位和結果判讀上沒有明顯差異，而特定標志物基因水平的檢測一般采用的是熒光原位雜交，為將兩者結合起來，采用免疫熒光作為特定標志物蛋白表達水平的檢測方法，建立同時檢測標志物蛋白和基因水平的方法。JIMT-1 細胞涂片分別采用上述方法進行HER2 蛋白的免疫熒光檢測和 HER2 基因的熒光原位雜交檢測以及兩者的聯合檢測。結果如圖2所示，JIMT-1 細胞中 HER2 蛋白圍繞細胞的一圈，HER2 基因檢測為細胞核內的多個信號點；HER2 蛋白和基因聯合檢測中，可在同一細胞，不同通道下分別檢測到 HER2 蛋白和基因的表達情況，并且與單純的免疫熒光檢測 HER2 蛋白和熒光原位雜交檢測 HER2 基因結果相同，不影響HER2 蛋白表達水平和細胞定位以及基因拷貝數的判讀。兩種方法的聯合檢測結果與單純的蛋白和基因檢測結果相比，HER2 蛋白的定位和熒光強度均不受影響。

圖2 JIMT-1 細胞中 HER2 蛋白和基因檢測（400 ×；A：HER2 蛋白的 IF 檢測；B：HER2 基因的 FISH 檢測；C：IF 和FISH 聯合檢測）Figure 2 HER2 protein and gene detection of JTMT-1 cell (400 ×; A:IF stain of HER2 protein expression; B:FISH of HER2 gene expression; C:IF-FISH combined detection)

2.3 不同亞細胞定位靶標的蛋白和基因聯合檢測

分別對不同細胞亞定位的靶標進行蛋白和基因水平的聯合檢測，選取不同細胞定位的 HER2、pan-CK 和 Ki67，分別與 HER2 基因聯合檢測。結果如圖3 所示，HER2 為細胞膜定位，在細胞中為圍繞細胞的圈狀著色；pan-CK 為細胞漿定位，在細胞中為胞漿的片狀著色；Ki67 為細胞核定位，在細胞中為與細胞核重合的片狀著色。采用該方法可以在 JIMT-1 細胞中對不同定位的蛋白和 HER2基因進行聯合檢測。

圖3 細胞涂片中不同定位蛋白和 HER2 基因聯合檢測（400 ×）Figure 3 IF-FISH combined detection of different location protein in (400 ×)

3 討論

免疫組織化學是指將顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應，對相應抗原進行定性、定位、定量測定的一項新技術，其在病理診斷中具有重要的臨床意義，尤其是腫瘤的輔助診斷、標志物篩選和指導用藥等方面[7-8]。熒光原位雜交主要用于病理的輔助診斷和鑒別診斷、疾病預后評估和指導臨床靶向治療等，是近十年來臨床病理檢測中運用最為廣泛的一種分子遺傳學診斷技術[2]。兩者的應用領域和檢測方法有很高的重復性，并且目前的一些診療指南中已將兩者的應用聯合起來。例如乳腺癌病理檢測中 IHC 和 FISH 檢測HER2 蛋白和基因的表達狀態一致性很高，但也存在著差異，在不同研究中發現切片中進行 HER2蛋白和基因的檢測，其符合性差異較大，尤其對IHC 結果為 ++ 的情況下，其大約有一半是 FISH陰性[9]，《2014年NCCN 乳腺癌臨床實踐指南》和《乳腺癌 HER2 檢測指南（2014 版）》均建議先進行 HER2 蛋白的 IHC 檢測，HER2++ 樣本進行 FISH 的檢測。

免疫組織化學染色中通過顯色底物的不同，可以將目的蛋白顯示為不同的顏色[10]。文中比對了采用熒光二抗和酶標二抗對 HER2 蛋白進行檢測。兩者均可檢測到 HER2 的細胞膜定位，沒有明顯差異，同時比對其他的研究，可以看出兩種方法分別用于檢測目的蛋白的表達沒有明顯差異[11]。由于顯色原理的差異，染色后兩者片子的讀片情況和保存條件不同。IF 染色后顯色為熒光信號，因此熒光信號隨著觀察的次數和曝光時間的長短而逐漸淬滅，添加防淬滅劑，可以在一定程度上減少熒光的淬滅，另外采用量子點等新型熒光基團作為標記熒光有更好的效果，總的來說，IF 染色后的片子應盡快讀片并將其保存在避光、低溫的環境中。酶標二抗顯色的原理為 DAB 催化底物后，特定位置色素的沉積，其在封片后會一直保存在原來的位置，顯微鏡的觀察不會對其產生影響，因此 IHC 染色的片子可以進行長期的觀察，并且對其染色后片子的保存沒有特定要求。關于結果的定性和半定量研究，與免疫組化相比，免疫熒光同樣可以采用熒光強度值來顯示蛋白的表達量[12]。同時 FISH 檢測中多數為熒光素標記的探針識別目的基因特定片段，顯色后在熒光顯微鏡下觀察。同一細胞特定標志物不同表達層面的研究，對于基礎研究和臨床診斷都具有重要的意義，尤其在乳腺癌 HER2 的臨床診療過程中。目前已有相關研究在 mRNA 水平研究中采用 FISH 和 IF 結合的方法來對標志物的表達進行檢測[13]，但是分別用于檢測基因和蛋白表達水平的未見報道。本研究中優化 IF 和 FISH 檢測方法，將蛋白和基因水平表達研究方法結合起來，采用HER2 蛋白高表達細胞系 JIMT-1，作為研究對象[14]，選用熒光素標記的二抗作為顯色底物進行特定標志物蛋白水平的檢測，同時結合不同波長熒光素標記的基因探針，進行特定標志物基因水平的檢測，可以達到同一細胞中特定標志物蛋白和基因水平兩個層面的檢測，排除了切片厚度、腫瘤異質性、染色差異等對特定標志物表達情況判讀的影響。組織病理檢測與細胞系涂片相比，前者需要的額外操作是組織切片的脫蠟和抗原的修復，而這些步驟的操作并不會影響細胞中 HER2 蛋白和基因的表達，同時不會影響方法中 IF 和 FISH 聯合檢測和結果的判讀，只需要在前處理操作過程中添加相應步驟，因此本方法在組織病理上應用的可行性很高。

本文介紹的方法適用于細胞中所有標志物的檢測，同時 FISH 檢測中，同樣可以對其他的基因探針和染色體探針進行檢測，不局限于 HER2 基因。值得注意的是，采用該方法還可以對多個標志物同時檢測，例如分別采用不同波長熒光素（647～700 nm 附近的近紅外、594 nm 附近的紅色、555 nm附近的橙色、488 nm 附近的綠色、360 nm 附近的藍色等）標記的不同蛋白標志物或者基因[15]，通過調整熒光素的選擇和顯微鏡不同通道的波長選擇，可以對多個標志物的蛋白和基因水平進行檢測。

本文提供了一種用于細胞和組織中同時進行IF 和 FISH 的檢測方法，以達到在同一細胞中對蛋白和基因水平的同時檢測。該方法在組織中的應用和結果的判讀方面還需要更多的研究，進一步完善該方法并將其真正應用到臨床輔助診斷中，有希望減少臨床的工作量同時提高結果的準確性，為臨床診斷提供一種更方便、可靠的檢測方法。