P21蛋白表達與正常宮頸組織癌變關系的meta分析

沐超，熊敏涵，袁煒，李麗紅，王婷，胡新榮

宮頸癌是起源于子宮頸上皮的惡性腫瘤。據2018年全球癌癥統計，宮頸癌的發病率和死亡率排在女性惡性腫瘤的第四位，在發展指數較低的地區，宮頸癌的發病率和死亡率僅次于第一位的乳腺癌。人類乳頭瘤病毒（HPV）的感染是宮頸癌的高危因素，其他危險因素還包括 HIV 感染、吸煙、懷孕次數和使用口服避孕藥等[1]。P21waf1 蛋白（P21 蛋白）是抑癌基因 p21WAF1/CIP1的表達產物，屬于細胞周期依賴激酶抑制因子。當細胞受到損傷后，P21 蛋白能夠與細胞周期蛋白復合物相結合，致使其喪失活性，從而使細胞周期停滯在 G1 期，讓受損的細胞有充分的時間修復，參與了細胞生長、發育、分化、衰老以及損傷修復等多種功能的調節[2-3]。已有研究顯示P21 蛋白的異常表達可能與宮頸癌、宮頸上皮內瘤變（CIN）的發生發展有關[4]。

目前，有多項研究報道了 P21 蛋白在宮頸癌及 CIN 中的表達情況，但尚未見其在宮頸癌變中差異表達的系統評價。我們通過檢索和篩選相關文獻，系統評價了正常宮頸組織、CIN 和宮頸癌中P21 蛋白表達的陽性率，進而闡明 P21 蛋白表達與宮頸癌變的關系，為檢測細胞周期紊亂、評估宮頸癌的惡性行為和預后提供分子標記及循證依據。

1 資料與方法

1.1 檢索策略

檢索數據庫 Pubmed、Web of Science、Medline、CBMdisc、CNKI、維普中文期刊、萬方數據，檢索時間自建庫至 2020年5月，中文檢索關鍵詞包括：P21waf1、宮頸癌、宮頸腫瘤。英文檢索關鍵詞包括：P21waf1、Cervical Neoplasms、Cervical Carcinoma。

1.2 納入和排除標準

1.2.1 P21 蛋白檢測方法 采用免疫組織化學法進行檢測。

1.2.2 研究類型 P21 蛋白在宮頸病變組織中表達差異的病例-對照研究，對應文獻已見刊并具有相應資料。文種限中文和英文。

1.2.3 研究對象：①所有病例經病理診斷明確；②全部受試者取材前都未經放化療；③研究方法相似；④全部受試者不界定民族、種族、國籍等。

1.2.4 排除標準：①重復文獻；②無相應對照組，數據提供不全；③非免疫組織化學法、非正常宮頸組織作為對照；④綜述、動物研究、會議摘要及病例系列報道等。

1.2.5 文獻篩選與資料提取 文獻篩選和資料提取分別由兩位研究人員獨立進行，涉及不一致的地方，通過協商或第三方裁定。提取信息包括：題目、作者姓名、發表年限、納入病例的年齡范圍、病例總數、宮頸病變中 P21 蛋白表達陽性數等。

1.3 統計學處理

運用 Revman5.3 軟件對所有納入的研究進行分析。通過查找相關資料，選擇比值比（odds ratio，OR）作為合并效應量，95% 為其可信區間（95%CI）。首先，對納入的原始數據進行異質性檢驗（檢驗水準為 α = 0.05），采用森林圖和I2統計量來判斷研究間的異質性。根據《Cochrane 系統評價手冊》，I2＞ 50% 則認為研究間存在異質性。對于存在異質性的結果，利用漏斗圖進行發表偏倚的判斷。最后，進行敏感性分析，如果敏感性分析前后結果沒有本質上改變，則說明結果穩定且較為可信；如果敏感性分析得到的結果不同，則在排除異常的研究后重新分析，并探討該研究影響合并效應的原因。

2 結果

2.1 文獻檢索結果

通過數據庫檢索，初步得到 497 篇文獻，其中 Pubmed 227 篇、Web of Science 97 篇、Medline 56 篇、CBMdisc 32 篇、CNKI 26 篇、維普 24 篇、萬方 35 篇，按照標準嚴格篩選后，總共納入文獻14 篇[5-18]，共 1588 例受試者，包括正常宮頸組織269 例、CIN 390 例，宮頸癌 929 例。文獻篩選流程見圖1。

圖1 文獻篩選流程Figure 1 Literature screening process

2.2 納入研究的基本特征和方法學質量評價

14 份研究報道了正常宮頸組織和宮頸癌中P21 蛋白表達的情況；8 份研究[6,8-10,12-13,17-18]報道了 CIN 中 P21 蛋白表達的情況。納入研究的基本特征和方法學質量評價分別見表1 和表2。

表1 納入研究的基本特征Table 1 Basic features of the included studies

表2 納入研究的方法學質量評價（紐卡斯爾-渥太華量表）Table 2 Methodological quality evaluation of included studies (Newcastle-Ottawa Scale)

2.3 Meta 分析結果

2.3.1 宮頸癌組與正常宮頸組共 14 個研究報道了宮頸癌組（929 例）與正常宮頸組（269 例）中 P21 蛋白的表達情況。森林圖顯示：I2= 86%，P＜ 0.00001，各項研究間存在異質性，采用隨機效應模型；OR = 9.51，95%CI（2.82，32.11），P= 0.0003，可知宮頸癌組與正常宮頸組 P21 蛋白表達差異有統計學意義（圖2）。

圖2 宮頸癌組與正常宮頸組 P21 蛋白表達的比較Figure 2 Comparison of P21 protein expression between cervical cancer group and normal cervical group

2.3.2 宮頸癌組與 CIN 組共 8 個研究報道了宮頸癌組（404 例）與 CIN 組（390 例）中 P21 蛋白的表達情況。森林圖顯示：I2= 79%，P＜ 0.0001，各項研究間存在異質性，采用隨機效應模型；OR =1.18，95%CI（0.54，2.55），P= 0.68，可知宮頸癌組與 CIN 組 P21 蛋白表達差異無統計學意義（圖3）。

圖3 宮頸癌組與 CIN 組 P21 蛋白表達的比較Figure 3 Comparison of P21 protein expression between cervical cancer group and CIN group

2.3.3 CIN 組與正常宮頸組 共 8 個研究報道了 CIN 組（390 例）與正常宮頸組（150 例）中 P21蛋白的表達情況。森林圖顯示：I2= 72%，P=0.0008，各項研究間存在異質性，采用隨機效應模型；OR = 3.25，95%CI（0.97，10.87），P= 0.06，可知 CIN 組與正常宮頸組 P21 蛋白表達差異無統計學意義（圖4）。

圖4 CIN 組與正常宮頸組 P21 蛋白表達的比較Figure 4 Comparison of P21 protein expression between CIN group and normal cervical group

2.3.4 發表偏倚的識別 分別對宮頸癌組與正常宮頸組、宮頸癌組與 CIN 組、CIN 組與正常宮頸組進行漏斗圖繪制，結果見圖5A、B、C。由圖知，三個比較組的漏斗圖對稱性欠佳，提示可能存在發表偏倚。

圖5 漏斗圖（A：宮頸癌組與正常宮頸組；B：宮頸癌組與 CIN 組；C：CIN 組與正常宮頸組）Figure 5 Funnel plot (A:Cervical cancer group versus normal cervical group; B:Cervical cancer group versus CIN group; C:CIN group versus normal cervical group)

2.3.5 敏感性分析 以 OR 為效應尺度指標，用“去除單項研究法”考察單項研究對總合并效應量的影響，發現當去除文獻[6]和[10]兩項研究后，重新進行分析，結果分別為：①宮頸癌組與正常宮頸組I2= 0%，P= 0.64，達到同質，符合固定效應模型條件，可知 P21 蛋白表達陽性率，宮頸癌組大于正常宮頸組[OR = 17.75，95%CI（10.87，28.99）]，差異有統計學意義（P＜ 0.00001）（圖6A）。②宮頸癌組與 CIN 組I2= 59%，P= 0.03，仍存在異質性，采用隨機效應模型，可知 P21 蛋白表達陽性率，宮頸癌組與 CIN 組的差異無統計學意義[OR = 1.88，95%CI（0.97，3.62），P= 0.06]（圖6B）。③CIN 組和正常宮頸組I2= 43%，P= 0.12，異質性降低，符合固定效應模型條件，可知 P21 蛋白表達陽性率，CIN 組大于正常宮頸組[OR = 6.10，95%CI（3.03，12.32）]，差異有統計學意義（P＜0.00001）（圖6C）。其余各個評價指標行敏感性分析，結果均一致。

3 討論

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤，嚴重威脅著女性的健康。目前宮頸癌的治療包括手術切除、放化療以及靶向治療[19]，為了提高宮頸癌患者無進展生存率，提高患者的生活質量，降低治療毒副作用，在探討宮頸癌最佳治療方案的同時也需要探究能夠評估宮頸癌惡性行為和預后的相關分子。p21WAF1/CIP1基因表達的 P21waf1 蛋白，定位于細胞核，是 P53 途徑重要的下游蛋白[20]。作為細胞周期的負性調控因子，生理情況下，P21 蛋白參與了細胞生長、衰老以及受損后修復等過程。雖然P21 蛋白承擔著抑癌的角色，但是在許多研究中發現，它在腫瘤中的表達是上調的，其通過作用于G1/S 檢測點，參與了腫瘤的發生發展。P21 蛋白升高的原因可能是 P21 蛋白的表達被 p53 非依賴的通路誘導[21-22]，或者腫瘤已變成 p21WAF1/CIP1介導的抑制信號細胞，逃避了衰老（終末分化）和生長停滯[3]。因此，它可以作為檢測細胞周期紊亂、估計腫瘤惡性行為和預后的分子標記。

本次系統評價顯示：當剔除文獻[6]和[10]兩項研究結果后，三個組的異質性都出現了下降，通過對比前后森林圖和漏斗圖，可知這兩項研究出現了發表偏倚，對合并效應產生了較大的影響，同時也是異質性的來源，其原因可能與他們所報道的正常宮頸組織中 P21 蛋白表達陽性率高有關。在重新進行分析后，最后結果顯示：與正常宮頸組織相比，P21 蛋白在宮頸癌組以及 CIN 組中均表達上調，與多數學者報道的研究[5,7-9,11-18]結果一致，提示 P21 蛋白異常高表達增加了正常宮頸上皮癌變的風險；然而在以往的研究中，也有學者報道 P21蛋白在宮頸癌中表達是降低的。例如，苗立業等[23]認為 P21 蛋白在 CIN 和宮頸癌中表達陽性率逐漸減低，表達強度與病變級別呈負相關，究其原因可能與組蛋白去乙酰化酶 1（HDAC1）的作用有關。另外，在動物試驗中，Shin 等[24]發現與 p21(+/+)小鼠相比，p21(-/-) 小鼠宮頸病變更明顯，原因可能與外源性雌激素的使用有關。本次分析結果在較大數據層面上支持了 P21 蛋白在宮頸癌組大于正常宮頸組、CIN 組大于正常宮頸組，且兩組差異均有統計學意義。但是，宮頸癌組與 CIN 組比較的結果顯示 P21 蛋白表達差異無統計學意義，可能與樣本量較少有關，有待于更多的樣本量來明確宮頸癌P21 蛋白的表達水平是否高于 CIN。綜上所述，P21waf1 蛋白表達上調會促進正常宮頸組織癌變，檢測 P21waf1 蛋白的表達有助于評估宮頸癌的惡性行為和預后。

圖6 敏感性分析（A：宮頸癌組與正常宮頸組；B：宮頸癌組與 CIN 組；C：CIN 組與正常宮頸組）Figure 6 Sensitivity analysis (A:Cervical cancer group versus normal cervical group; B:Cervical cancer group versus CIN group;C:CIN group versus normal cervical group)

本次分析不排除有一定的局限性：①收集了公開發表的中、英文文獻，但 CIN 組樣本量仍較少；②國內、國外各個研究中的組織標本處理方法、免疫組化判定主觀性等可能會對原始數據的一致性產生影響。